Bioethanol production using adaptive evolution and CRISPR-Cas9 system with Gracilaria verrucosa and Gloiopeltis furcata hydrolyzate

Abstract

바이오매스로 생산한 에탄올은 화석 연료의 대체 자원의 하나라고 간주된다. 그러나 바이오에탄올이 대체에너지로 상용화하기에 경제적으로 장애가 있다. 이러한 결함을 개선하여 에너지원으로 사용하기 위한 연구할 필요가 있다. 탄수화물 함량이 높은 홍조류의 일종인 Gracilaria verrucosa와 Gloiopeltis furcata를 사용하였다. G. verrucosa를 슬러리 농도 12% (w/v), 질산(HNO3) 농도 500 mM, 처리 시간 90 분 동안 121°C로 열산가수분해(Acid hydrolysis)하여, 57 g/L의 단당을 생산했고, 16 units/mL의 Celluclast 1.5L 및 Cellic CTec2를 사용하여 효소당화 했을 때, 최대 61 g/L의 단당을 생산하였다. G. furcata는 처리온도 121°C에서 슬러리 농도 12% (w/v), 질산 농도 300 mM, 반응시간 60분 동안 열산가수분해 하였고, 이후 Cellic CTec2로 효소당화하여 61 g/L의 당을 획득하였다. 에탄올 수율 개선을 위해 2가지 방법을 사용하였는데, 1 장에서 Saccharomyces cerevisiae, Candida lusitaniae, Kluyveromyces marxianus 3 가지 균주를 사용해 고농도 Galactose에 적응진화(Adapted Evolution)한 균주를 사용하였고, 2장에서는 에탄올 생산에 관여하는 유전자를 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 변화시켜 이를 통해 발효하였다. Galactose를 대사하기 위해서는 Glucose 6-phosphate (G6P) 으로의 전환이 우선되어야 한다. Galactose 대사에 관여하는 집단을 GAL gene family라고 통칭하며, 이들 유전자는 단백질 GAL4에 의해 활성화된다. GAL4는 GAL80과 결합하면 억제되어 GAL gene family가 불활성화 된다. 하지만, GAL80은 GAL3와 결합하면서 GAL4의 불활성화를 방지할 수 있다. 따라서, 2장에서 Galactose 대사에 관여하는 GAL3와 GAL80의 유전자를 각각 조작하여 Galactose 대사의 개선의 여부에 대해 비교하였다. 그리고 G. verrucosa와 G. furcata 기질을 사용하여 각각 발효하였다.