Development of antigen delivery tools based on genetically engineered viruses

Abstract

어류 면역 주사는 50년 동안 진행되어 왔으며, 각종 예방 백신은 세균성 및 바이러스성 질병을 예방하거나 줄이는 데 상당한 역할을 해왔다. 대부분의 상업용 백신은 미생물을 불활성화한 형태로 효율적이고 효과적인 백신이라고 하기엔 다소 어려움이 있다. Inactivated vaccine의 단점을 극복하기 위해서는 다양한 백신의 이해와 활용이 필요하다. 본 연구에서는 항원성을 높이고 다수의 항원의 효율적이고 효과적인 전달 방법을 강구하기 위해서 바이러스를 기반으로 하는 delivery vehicles 개발에 초점을 맞추었다. Virus like particle (VLP)은 항원을 전달하기 위한 delivery vehicles로써 Split-intein (SpyTag/SpyCatcher)의 단일 isopeptide 결합을 이용해 자발적으로 두 개의 항원을 연결할 수 있다. 실험에서는 Streptocococcus iniae의 α-enolase와 SpyCatcher를 연결하고 표현에 SpyTag을 발현하도록 NNV VLP를 유전적으로 재구성하여 제작했다. 두 개의 분자를 혼합하는 방법으로 각각 1:1.5의 비율로 하여 6시간동안 반응했을 때, 표면에 S. iniae α-enolase를 가지는 NNV VLP가 성공적으로 제작되었다. 표면에 S. iniae α-enolase를 가지는 NNV VLP의 입자는 직경 약 40-50nm로 불규칙한 모양을 나타냈다. Complement inhibitor C4b-binding protein (C4bp)은 heptamer형성을 위한 oligomerization domain인 IMX313을 가지고 있는데, 이를 유전적으로 재조합하여 외래 항원의 oligomerization에 사용할 수 있다. 이러한 방법이 항원성 높여주는지 조사하기 위해서, S. iniae α-enolase와 IMX313을 재조합하여 단백질을 제작하고 이를 non-reducing PAGE를 통해 oligomerization을 검증하였다. α-enolase-IMX313을 주사한 넙치에서 α-enolase에 대한 항체가가 α-enolase만 주사한 넙치에서 보다 높게 나타났으며, 생존율 또한 더 높았다. 이 결과를 통해서 항원의 oligomerization이 체액성 경로를 통한 적응 면역반응을 향상시키는 효율적인 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다. Reverse genetics는 재조합 rhabdoviruse를 제작하는 기술로 이를 통해 attenuated 또는 replication-defective-single-cycle 바이러스성 백신이 연구 개발되고있다. 재조합 VHSV의 envelope에 S. iniae α-enolase를 발현하는 바이러스를 생성하기 위해서 α-enolase의 N-terminal과 C-terminal에 각각 VHSV glycoprotein의 signal peptide와 transmembrane region을 유전적으로 결합하고 이를 VHSV genome에 존재하는 N과 P 유전자 사이에 삽입하였다. α-enolase가 VHSV의 envelope에 spiking된 바이러스를 넙치에 주사했을 때 감염된 세포의 세포질에서 α-enolase를 발현하는 바이러스를 주사한 넙치보다 항체가가 높게 나타났다. 두번째로 genome 상에서 G 유전자가 제거된 재조합 VHSV를 이용하여 외래 항원을 전달하기 위해 NNV VLP를 제작하는 RNA2 유전자를 VHSV의 gnome에 존재하는 N과 P유전자 사이에 삽입하여 VHSV glycoprotein을 발현하는 EPC세포에서 바이러스를 제작하였다. 제작된 rVHSV-ΔG-NNVCap은 Western blot을 통해 바이러스 genome replication에 의한 NNV capsid 단백질이 생산될 수 있음을 확인하였고, 바이러스가 감염된 세포에서도 NNV VLP가 온전한 형태를 이루는 것을 전자 현미경으로 관찰했다. Polyhedrin promoter의 작동으로 인해 heterologous 단백질을 발현하는 재조합 baculovirus는 곤충세포에서 재조합 단백질을 발현하거나 물고기세포에 유전자를 전달하기 위해 바이러스 vehicles로 활용된다. 실험에서는 세 종류의 재조합 AcMNPV를 제작했는데, 첫번째로 polyhedrin promoter 아래에 VHSV glycoprotein의 signal peptide와 transmembrane 부위를 baculovirus의 glycoprotein인 GP64의 것으로 바꾸어 baculovirus의 envelope에 spiking되도록 하였고, 두번째로 물고기 세포에서 항원을 발현하기 위해 CMV promoter로 VHSV glycoprotein을 발현할 수 있는 cassette를 삽입해 주었고, 세번째로 앞서 언급한 두 가지의 방법을 동시에 가지도록 디자인 하였다. 더 나아가서, 곤충세포에서뿐만 아니라 물고기 세포에서도 발현할 수 있게 하기 위해, 흰반점병 바이러스(WSSV)의 ie1 promoter를 이용하여 VHSV glycoprotein 유전자, HIRRV glycoprotein 유전자 그리고 T2A peptide를 이용해 동시에 VHSV와 HIRRV의 glycoprotein 유전자를 발현할 수 있는 cassette를 삽입하여 세 종류의 바이러스를 제작했다. 목적에 맞게 제작되었는지 확인하기 위해서 western blot을 통해 재조합 AcMNPV의 envelope에 VHSV glycoprotein의 발현을 확인했고, EPC 세포에 제작된 여러 AcMNPV를 감염해 세포 내에서 glycoprotein의 발현 유무를 qRT-PCR을 통해 정량하여 확인하였다. 이렇게 확인된 재조합 AcMNPVs를 넙치에 주사하였을 때, VHSV 또는 HIRRV에 대한 어느 정도의 방어능을 보였다. Alphavirus는 백신 도구로 사용해 heterologous 항원의 전달에 이용되어 왔다. 여러 가지 방법 중 실험에 사용한 SAV DNA replicon 백신은 두 개의 ORF 유전자를 암호화하는 positive-stranded RNA genome을 가진 salmonid alphavirus(SAV)를 이용했다. 이 구조 단백질을 암호화 하는 유전자를 eGFP, Metridia luciferase 또는 VHSV glycoprotein 유전자로 대체하여 항원의 발현을 조사하고 대중적으로 사용하는 CMV 발현 벡터와 그 효율을 비교하고자 하였다. 정확한 바이러스 genome을 제시하기 위하여 바이러스 genome의 5’과 3’에 각각 hammerhead ribozyme과 HDV를 결합하였고 이렇게 제작된 벡터의 효율이 CMV 발현 벡터보다 더 높음을 luciferase activity를 통해 증명 하였다. 더 나아가 26S subgenomic promoter의 정확한 region을 조사하기 위해서 3종류의 예측된 promoter 중에서 -98/+14(fully active promoter)에 의한 항원의 발현 정도가 가장 높게 나타나는 것을 luciferase activity를 통해 확인했다. Flock house virus (FHV)를 기반으로 한 곤충 nodavirus RNA replicon을 제작하고 그 효율을 측정했을 때, capsid 단백질의 합성양이 곤충세포에서 높은 비율을 나타냈다는 보고를 기반으로 본 실험에서는 어류 betanodavirus인 redspotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV)를 이용하여 DNA layered replicon 벡터를 제작하고자 하였다. 벡터는 두개의 cassette로 구성되어있는데 CMV promoter 아래에 hammerhead ribozyme과 HDV를 사용해서 유전자는 RNA 의존적 RNA 중합효소를 암호화하는 RNA1과 capsid 단백질을 암호화하는 RNA2 유전자 대신에 VHSV glycoprotein을 암호화하는 유전자로 각각 디자인 했으며 ribozyme을 사용하지 않은 시스템의 벡터도 함께 제작했다. Ribozyme을 이용하여 제작된 DNA layered replicon 벡터의 VHSV glycoprotein 발현을 qRT-PCR로 정량했을때, EPC와 BHK 세포에서 다른 발현 벡터보다 그 값이 높게 나타났다. 앞서 언급된 여러 기술은 heterologous 항원을 전달하고 적응 면역 반응을 강화시키기 위해 연구 개발 되었다. 기존의 상용화 백신의 결함을 극복하기 위해 다양한 방법을 연구했고, 이는 병원체를 이루는 구조 단백질 중 하나의 항원을 전달하는 형태이기 때문에 상용화된 Whole vaccine 보다 효과가 제한적일 수 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 항원 전달 기술은 외래 항원을 온전히 전달할 수 있는 도구로 사용될 수 있고 나아가 항원을 선정하는데 응용 가능성을 확인하였다. 이러한 기술을 이용해서 항원 수를 늘리거나 어체 내에 삽입 효율을 높이는 방향으로 연구된다면 미래의 양식 산업에 사용될 백신으로서 주요한 역할을 할 것으로 사료된다.

Fish immunization has been carried out for 50 years, and various prophylactic vaccines have played a substantial role in preventing or reducing bacterial and viral diseases. Most commercial vaccines have been inactivated but there are limits that unable to be an efficient and effective enhancing vaccines. To overcome the defect of inactivated vaccines, the comprehension and exploitation of diverse commercial-vaccine types are needed. In the present study, we focused on the development of delivery vehicles for subunits to enhance the antigenicity and to devise efficient and effective delivery methods of an antigen or multiple antigens. Virus-like particles (VLPs) can exploit delivery vehicles of antigens by protein fusion with the split-intein (SpyTag/SpyCatcher) spontaneously from a single isopeptide bond, connecting two antigens. We recombinantly constructed with SpyCatcher fused α-enolase of Streptococcus iniae and NNV VLP connected to SpyTag on their surface. As a method to mix two molecules, NNV VLPs displaying S. iniae α-enolase on the surface were successfully produced in the ratio of compound weight 1:1.5 corresponding to α-enolase-SpyCatcher of 1.5 for 6h. The particles of NNV VLPs displaying S. iniae α-enolase showed an irregular and size of about 40-50 nm in diameter. Complement inhibitor C4b-binding protein (C4bp) has an oligomerization domain for heptamer formation as an IMX313 that can be used for oligomerization of foreign antigen by genetical fusion. To investigate increasing antigenicity, α-enolase of Streptococcus iniae oligomerization by fusion with IMX313 was verified by non-reducing PAGE. The olive flounder immunized with α-enolase-IMX313 showed high antibody titer against enolase and high survival rate than the olive flounder immunized with α-enolase alone. This result suggests that antigens oligomerization can be an efficient way to improve adaptive humoral immunity. Reverse genetics as a way to generate recombinant piscine rhabdoviruses have been developed attenuated or replication-defective-single-cycle viral vaccines. To generate S. iniae α-enolase expressing on the recombinant VHSV envelope, the α-enolase fused N-terminally with VHSV glycoprotein’s secretion signal and C-terminally with transmembrane C-terminal sequence was inserted between N gene and P gene of VHSV genome. The olive flounder immunized S. iniae α-enolase spiked on the envelope of VHSV showed significantly higher antibody titer than fish immunized with rVHSV expressing S. iniae α-enolase in the cytoplasm of infected cells. Moreover, recombinant VHSV deleted G gene on viral genome harboring NNV capsid protein sequence between N gene and P gene as a single-cycle replicon virus was rescued in the glycoprotein VHSV expressing EPC cells. The rVHSV-ΔG-NNVCap can produce NNV capsid proteins by viral genome replication using Western blot, and NNV VLPs were observed in infected cells by electron microscopy. Recombinant baculovirus expressing heterologous protein by polyhedrin promoter utilizes viral delivery vehicles that express the recombinant protein in insect cells or deliver genes into fish cells. We generated recombinant AcMNPV harboring ⅰ) polyhedrin promoter-driven VHSV glycoprotein that displayed on viral surface by genetic fusion using SP and TM region of GP64 gene ⅱ) CMV promoter-driven VHSV glycoprotein gene for the expression in fish cells ⅲ) above mentioned two cassettes. Moreover, the production of recombinant baculovirus harboring WSSV ie1 promoter-driven VHSV glycoprotein gene, HIRRV glycoprotein gene, or VHSV-HIRRV glycoprotein genes fused by T2A for protein expression on viral surface in both insect cells and fish cells was conducted. The VHSV glycoprotein on the viral envelope of recombinant AcMNPVs was detected by Western blot, and the expression of delivered genes in the baculovirus genome was quantified from EPC cells infected each of recombinant AcMNPVs by qRT-PCR. Since the olive flounder inoculated with recombinant AcMNPVs indicated partly protective efficacy than the groups immunized the control and eGFP-expressing viruses. Alphaviruses have been utilized for the delivery of heterologous antigens as a vaccine tool. Among several ways, we focused on DNA replicon vaccine of salmonid alphavirus (SAV) that has positive-stranded RNA genome encoding two ORF genes, which the viral structural protein gene was replaced with an enhanced green fluorescent protein (eGFP), secreted Metridia luciferase or glycoprotein of VHSV gene for investigation antigen expression efficiency comparing with conventional CMV promoter-driven vectors. The DNA layered SAV vectors harboring hammerhead ribozyme and HDV under the CMV promoter for presenting precise vial genome showed higher foreign gene expression than conventional vectors in fish cells by measuring luciferase activity. Moreover, the fully active promoter (-98/+14), one of 26S subgenomic promoter predicted regions, was stronger than other regions by luciferase activity. Insect nodavirus RNA replicon based on flock house virus (FHV) reported that synthesis of capsid proteins showed a high rate in insect cells. We constructed that fish betanodavirus, redspotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV), was used for DNA layered replicon vectors encoding bipartition cassette - RNA 1 for RNA-dependent RNA polymerase and RNA 2 for capsid protein replaced with a foreign antigen, a glycoprotein of VHSV, downstream of the CMV promoter and constructed with either hammerhead ribozyme and HDV or not. The DNA layered replicon vector harboring ribozyme for precise viral genome was higher glycoprotein expression than conventional DNA vector in both EPC and BHK cells by qRT-PCR, which protective efficacy was similar to above in vitro experiment. According to the thesis, these technologies have been advanced to deliver heterologous antigens and enhance the adaptive immune response. Although various ways were studied to overcome the defect of conventional vaccines, several delivery forms showed limited to deliver a kind of antigen of pathogen structural proteins than a commercial whole vaccine. However, it can exploit a delivery tool with foreign antigens and a way of antigen exploration. Furthermore, these technologies can be enveloped by increasing the number of antigens or increasing the insertion efficiency in fish as a great promise for the future of aquaculture vaccines.