Exploration of effective cryoprotectants and preservation method for a freshwater microalgae, Scenedesmus species

Abstract

Microalgae has been used as one of important biological resources in various industrial sections including functional foods and chemicals. However, the cryopreservation method used for long-term preservation of this group of microorganisms has not been well developed. Four species of Scenedesmus with high lipid content were chosen to develop an efficient long-term cryopreservation method. Various chemicals including glycerol, DMSO, and methanol were tested with each species to find the most suitable cryoprotectants (CPAs) for this genus. Three steps cryopreservation method were evaluated; 1 step: -40°C (75min), 2 steps: -80°C (125min), 3 Step -196°C using liquid nitrogen. Among the tested chemicals followed by cryopreservation, 15% methanol was the most efficient cryoprotectant for Scenedesmus species. Then, in order to confirm the effectiveness of the 3 Steps Cryopreservation method (3SC), the preservation rates in the -80°C cryopreservation method (Control), and the samples without the cryoprotectants (No CAPs) were compared. As a result, the survival rates of all species were the highest in 3SC and the lowest in No CAPs. In addition, Chlorophyll a and lipid contents were also determined before and after cryopreservation of all species to test the cell physiological damage effects, the results indicated that the content of chlorophyll a of the harvested cells was increased in all species after cryopreservation whereas the lipid content decreased. There was the highest increase in chlorophyll a and the lowest decrease in lipid content after cultivation of all strains cryopreserved by the 3SC method indicating that such method is much more efficient in preserving cells than the control (-80°C cryopreservation method). In addition, the preservative rate of this strain was further analyzed by supplemental preservatives, anti-freezing protein (AFP) and sucrose. As a result, Methanol 15% + Sucrose 10% + AFPI + AFPIII showed the highest number of viable cells which was similar survival number of cells as compared to that of commercially available cryopreservation kit reagents. In conclusion, it was confirmed that Scenedesmus acutus has the highest number of viable cells after growth, cultivation, and cryopreservation among the four strains. The cryoprotectants 15% methanol and 3SC method were most suitable for preservation of Scenedesmus.

미세 조류는 기능성 식품, 화학 제품 등 다양한 산업 분야에서 중요한 생물 자원 중 하나로 활용되고 있다. 그러나 이 미생물의 장기 보존을 위해 사용되는 동결 보존 방법은 잘 개발되지 않았다. 효율적인 장기 냉동 보존 방법을 개발하기 위해 지질 함량이 높은 4 종의 Scenedesmus를 사용하였다. 글리세롤, DMSO 및 메탄올을 포함한 다양한 화학 물질을 각 종에 대해 테스트하여 이 속에 가장 적합한 동결 보존제를 찾았다. 동결보존법으로 3 단계 보존 방법을 이용하였다. 1 단계: -40 ° C (75 분), 2 단계: -80 ° C (125 분), 3 단계: -196 ° C;(액체 질소). 냉동 보존이 이후 사용한 동결보존제로 사용된 화학 물질 중에서 15 % 메탄올이 Scenedesmus 종에 대해 가장 효율적인 냉동 보존제였다. 이후 3 단계 냉동 보존법 (3SC)의 유효성을 확인하기 위해 -80 ° C 냉동 보존법 (대조군)과 냉동 보호 제가 없는 시료 (보존제 없음)의 보존율을 비교하였다. 결과적으로 균주의 보존율은 3SC에서 가장 높았고 보존제가 없는 시료에서 가장 낮았다. 또한 모든 종의 냉동 보존 전후에 엽록소 a와 지질 함량을 측정하여 세포 생리적 손상 효과를 테스트 한 결과, 냉동 보존 후 재배양한 시료에서는 세포 회복을 위해 모든 균주에서 엽록소 a의 함량이 증가한 반면 지질 함량은 감소한 것으로 나타났다. 결과적으로 3SC 방법으로 냉동 보존 한 모든 균주에서의 엽록소 a가 가장 많이 증가하고 지질 함량이 가장 낮았으며 이는 3 단계 냉동 보존 방법이 기존의 냉동 보존보다 세포 보존에 훨씬 더 효율적임을 나타낸다. 그리고 전반적으로 Scenedesmus acutus가 4 가지 균주 중 가장 높은 cell의 생장값, 재배양, 냉동 보존된 세포의 생존 수를 갖는 것으로 확인되었다. 추가적으로 이 균주에 AFP (Anti-Freezing Protein)와 sucrose를 첨가 한 보존제에서의 보존율을 확인한 결과 Methanol 15% + Sucrose 10 % + AFPI + AFPIII가 가장 높은 보존율을 나타냈으며 이는 시판되는 cryopreservation kit 시약과 유사하거나 보다 더 높은 보존율을 보였다. 결론적으로, Scenedesmus 종의 보존에는 동결 방지제 15% Methanol 와 3SC 방법이 가장 적합하였다.