Fabrication of phycocyanin based fibrous membrane coated fish collagen for bone regeneration
- Abstract
- 골은 인체 내에서 장기를 보호하고, 혈액을 생성하고, 칼슘을 저장하는 등의 역할을 하고 있다. 이러한 골 조직의 손실이 발생하였을 때에, 조직 재생을 돕기 위한 나노, 마이크로 단위의 막에 대해 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 이러한 막을 제작하기 위해 다양한 합성 및 천연고분자를 사용하고 있다. 본 연구에서는 골 재생용 의료기기를 제작하기 위해 골재생효능이 확인된 피코시아닌 추출물과 합성고분자인 폴리락틱액시드 (PLA; lactic acid)와 천연 고분자인 알지네이트 (SA; Sodium alginate)를 이용하여 막을 제작하여, 친수성 막을 형성하기위해 생선 유래 콜라겐 (Col; Collagen)을 이용하였습니다. 먼저 피코시아닌은 MC3T3-E1에서 독성이 확인 되지 않았고 ALP (Alkaline phosphatase) 증가를 확인하였다. 또 골 생성 정도를 Alizarin Red S staining을 통해 확인하였다. 제작된 PLA (PLA), PLA/sodium alginate (PLA/SA), PLA/calcium alginate (PLA/CA), PLA/calcium alginate/phycocyanin (PLA/CA/PC), PLA/calcium alginate/collagen/phycocyanin (PLA/CA/PC/Col) fiber를 주사전자현미경을 통해 관찰한 결과 비드의 형성이 관찰되지 않았고, 콜라겐을 이용한 그룹에서 표면의 콜라겐 형성을 확인할 수 있다. 또한 각각 막의 표면에서 접촉 각을 측정하였을 때 118°, 64°, 50°, 24°, 22°로 점점 낮아 지는 것을 확인할 수 있다. 세포 부착을 세포 형광 염색을 통해 확인하였으며, 막에서의 세포 분화, 골 생성을 확인하기위해 Alizarin Red S staining을 이용하여 확인하였다. 마지막으로 동물에서의 골 생성 정도를 확인하기 위해 동물실험을 진행하였고, Micro-CT를 측정한 결과 PLA/CA/PC/Col fiber에서의 골 재생 효능이 Control, PLA fiber보다 우수 한 것을 확인할 수 있다. 이로서 본 연구에서 제작한 PLA/CA/PC/Col fiber가 골 재생을 위한 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- Issued Date
- 2021
- Awarded Date
- 2021. 2
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 4차산업융합바이오닉스공학과
- Advisor
- 정원교
- Table Of Contents
- 1. Introduction 1
1.1. Tissue Engineering 1
1.2. Bone 3
1.3. Phycocyanin 6
1.4. Collagen 9
1.5. Electrospinning 10
2. Materials and methods 11
2.1. Materials 11
2.2. Extract of crude phycocyanin from spirulina maxima 11
2.3. Anti-oxidant and anti-inflammatory effect of crude phycocyanin 12
2.3.1. DPPH radical scavenging activity 12
2.3.2. Hydrogen peroxide radical scavenging assay 12
2.3.3. Cytotoxicity and nitric oxide (NO) production on RAW 264.7 cells 13
2.4. Extraction of acid-soluble collagen (ASC) and pepsin soluble collagen (PSC) 14
2.5. Characterization of ASC and PSC 15
2.5.1. Sodium sodecyl sulphate polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE) 15
2.5.2 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis 16
2.5.3. X-ray diffraction analysis 16
2.5.4. UV absorbance analysis 16
2.5.5. Amino acid contents 17
2.6. Cell experiments 17
2.6.1. Cell culture 17
2.6.2. Cell viability assay 17
2.6.3. Determination of alkaline phosphatase activity 18
2.6.4. Determination of ROS level 18
2.6.7. Mineralization analysis 19
2.6.8. Western blot analysis 19
2.7. Preparation of nano/micro fibrous membrane 20
2.8. Nano/micro fibrous membranes characterization 21
2.8.1. Contact angle test on fibrous membranes 21
2.8.2. Scanning electron microscope analysis 22
2.8.3. Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy 22
2.8.4. X-ray diffraction analysis 22
2.9. In vitro preosteoblast response on the fibrous membrane 23
2.9.1. Cell viability on fibrous membrane 23
2.9.2. Cytoskeleton organization and phenotype study 23
2.9.3. Mineralization Analysis on Fibrous Membrane 23
2.10. In vivo in mouse calvarial defect 24
2.10.1. Mouse calvarial defect model and implantation of fibrous membranes 25
2.10.2. Micro-computed tomography analysis 25
2.10.3. Histological analysis 25
2.11. Statistical analysis 26
3. Results 26
3.1. Antioxidant effect of crude phycocyanin 26
3.2. Inhibitory effect of NO production of crude phycocyanin on RAW 264.7 macrophage 27
3.3. Characterization of extracted collagen 30
3.3.1. SDS-PAGE analysis of extracted collagen 30
3.3.2. UV spectrum analysis of extracted collagen 30
3.3.3. FTIR spectra analysis of extracted collagen 30
3.3.4. XRD analysis of extracted collagen 31
3.4. Amino acid components 34
3.5. Cytotoxicity and ALP activity of crude phycocyanin on MC3T3-E1 36
3.6. Anti-oxidant and anti-inflammation of crude phycocyanin in MC3T3-E1 36
3.6.1. ROS scavenging effects of crude phycocyanin 36
3.6.2. Alkaline phosphatase (ALP) activity on ROS environment 37
3.6.3. Alkaline phosphatase (ALP) activity on the inflammatory environment 37
3.7. Effect of crude phycocyanin on mineral deposition in MC3T3-E1 43
3.8. Expression level of phenotypic markers of osteoblastic differentiation 43
3.9. Fabrication and characterization of fibrous membranes 46
3.10. In vitro performance on fibrous membranes 50
3.10.1. Cell viability and adhesion 50
3.10.2. Mineralization on fibrous membranes 50
3.11. In vivo experiments 55
4. Discussion 56
5. Conclusion 58
6. Reference 59
- Degree
- Master
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- 대학원 > 4차산업융합바이오닉스공학과
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