Generation of recombinant Hirame rhabdovirus (HIRRV) using Reverse Genetics and attenuation by deletion of NV gene

Abstract

Novirhabdovirus속의 Hirame rhabdovirus (HIRRV)는 주로 넙치에 감염을 일으키는 바이러스로 근육 출혈, 복강 출혈 및 복수 축적, 신장 괴사 등의 임상 증상과 함께 대량폐사를 유발한다. Viral hemorrhagic septicemia (VHSV)와 Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV)에 관한 연구들에서 non-viron (NV) 유전자의 바이러스 복제 등 기능과 관련된 연구가 이루어졌으나 현재까지 HIRRV의 NV 유전자의 기능에 관한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구에서는 역유전학을 이용하여 다양한 재조합 HIRRV를 제작하였고, NV 유전자가 제거된 재조합 HIRRV를 제작하여 HIRRV의 병원성에 NV gene이 미치는 영향을 조사하였다. Wild-type HIRRV genome의 변형을 통해 wild-type HIRRV와 동일한 genome 서열을 갖는 HIRRV-wild, NV 유전자가 결여 된 rHIRRV-△NV, N과 P 유전자 사이에 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자를 갖는 rHIRRV-A-eGFP 및 NV 유전자 대신 VHSV 당 단백질 (G) 유전자를 갖는 rHIRRV-△NV-Gvhsv로 총 4가지의 재조합 HIRRV들을 생산하였다. 재조합 바이러스는 T7 RNA 중합 효소를 발현하는 EPC 세포에 각각의 재조합 HIRRV full genome 벡터와 helper 벡터 (N, P, L 유전자 발현 벡터)를 함께 transfection하여 제작되었고, EPC 세포에서 제작된 바이러스의 passage를 수행하였다. 그러나 NV 유전자가 결여된 rHIRRV-△NV와 rHIRRV-△NV-Gvhsv는 EPC 세포를 이용한 첫 번째 passage에서 뚜렷한 CPE를 나타내지 않았기 때문에 IRF9 유전자가 제거 된 EPC 세포에서 다시 passage를 수행하여 바이러스들을 rescue하였다. 각 재조합 HIRRV들의 성장 분석 결과, NV 유전자가 제거된 바이러스들 (rHIRRV-△NV 및 rHIRRV-△NV-Gvhsv)은 wild-type HIRRV와 rHIRRV-wild 에 비해 CPE 생성 및 성장 속도가 느린 것으로 나타났다. 또한 rHIRRV-△NV 및 rHIRRV-△NV-Gvhsv로 감염된 EPC 세포의 Mx 유전자 발현 수준은 wild-type HIRRV 및 rHIRRV-wild로 감염된 세포에 비해 현저하게 증가하였다. rHIRRV-△NV와 wild-type HIRRV 혹은 wild-type VHSV를 세포에 동시 감염시켰을 때 wild-type HIRRV뿐만 아니라 wild-type VHSV의 복제가 억제되는 것으로 나타났으며, rHIRRV-△NV의 titer가 높을수록 억제 정도가 높아지는 것으로 나타났다. 본 연구의 결과는 HIRRV의 NV 유전자가 숙주 세포의 I 형 인터페론 반응을 억제하는 역할을 함을 보여주는 것이며, 따라서 NV 유전자가 결여 된 재조합 HIRRV는 인터페론 억제능력 약화와 함께 분열능도 약화됨으로써 약독화 백신으로서의 사용 가능성을 지닌 것으로 여겨진다.

Hirame rhabdovirus (HIRRV) is a member of the genus Novirhabdovirus and has caused mortalities in olive flounder showing several symptoms such as intraperitoneal bleeding and accumulation of ascites fluid. Researches on the function of the non-virion (NV) gene, which was considered an unnecessary protein but only related to the virus's replication ability, has been actively conducted on VHSV and IHNV. This study aimed to generate recombinant HIRRVs using reverse genetics and analyze the NV gene's function in relation to pathogenicity and the possibility of virus attenuation. Recombinant HIRRVs produced through the modification of wild-type HIRRV genome were as follows; rHIRRV-wild that had the same genome sequence with wild-type HIRRV, rHIRRV-△NV lacking NV gene, rHIRRV-A-eGFP having enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene between N and P genes, and rHIRRV-△NV-Gvhsv having VHSV glycoprotein gene instead of NV gene. T7 RNA polymerase-expressing EPC cells were co-transfected with a vector harboring each recombinant HIRRV's genome and helper vectors (N, P, and L gene expressing vectors), and virus passages were performed in EPC cells. However, NV gene knock-out rHIRRV-△NV did not show evident CPE in EPC cells, so the virus was rescued by another passage in the IRF9 gene knock-out EPC cells. In the CPE progression and growth analysis of each recombinant HIRRV, NV gene knock-out viruses (rHIRRV-△NV and rHIRRV-△NV-Gvhsv) showed retarded CPE and growth compared to wild-type HIRRV and rHIRRV-wild. Mx gene expression level of EPC cells infected with rHIRRV-△NV and rHIRRV-△NV-Gvhsv was significantly increased compared to that of cells infected with wild-type HIRRV and rHIRRV-wild. Furthermore, rHIRRV-△NV inhibited the replication of not only wild-type HIRRV but also wild-type VHSV when cells were co-infected with the viruses, and the inhibition was dependent on the dose of rHIRRV-△NV. The results of this study suggest that recombinant HIRRVs were generated successfully, and the NVgene of HIRRV acts as a suppressor of the host cell's type I interferon response and recombinant HIRRVs lacking NV gene has a possibility to be used as attenuated vaccines.