Identification and biochemical characterization of antimicrobial compounds from aquatic organisms (Urechis unicinctus, Cyclina sinensis, and Silurus asotus)

Abstract

해양생물은 육상생물과는 달리 특수한 환경 (고압, 고염 등) 하에 놓여 있기 때문에 다양한 생리활성물질들이 발견되어 오고 있다. 본 논문에서 실험동물로 사용한 개불과 모시조개, 그리고 메기를 포함하는 수생 생물들 또한 그들이 노출된 환경에 존재하는 수많은 미생물과 극심한 변화로 인하여 다양한 생리활성 물질을 생성하고 활용할 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 개불(Urechis unicinctus)과 모시조개(Cyclina sinensis), 그리고 메기(Silurus asotus)로부터 항균성 물질의 동정과 생화학적 특성에 관해 보고하고자 한다. 제 1장은 개불에서 정제된 두 가지 항균성 물질(무척추형 라이소자임과 저분자 유기물)의 구조와 활성을 보고하고 있다. 우선 첫번째 물질인 무척추형 라이소자임 (Uu-ilys)은 재조합 단백질 생산과정을 통해 생산되었으며, 이는 그람양성 및 음성균에 대해 광범위한 항균 효과를 나타내었지만, 라이소자임 효소 활성은 다소 미약하였다. 이러한 결과는 무척추형 라이소자임의 항균 활성이 비효소적 요인에 의해서 나타날 수 있다는 가능성을 제시한다. 비효소적 항균 활성에 기여할수 있는 Uu-ilys 절편을 찾아본 결과, Uu-ilys의 C-말단의 세 가지 절편(Uu-ilys-α5, Uu-ilys-α5-6, Uu-ilys-α6)이 항균 활성을 가질 것으로 예측되었다. 이러한 Uu-ilys의 세 종류의C-말단 절편은 Uu-ilys과 마찬가지로 재조합 단백질 생산기술로 생산하였으며, 이를 사용하여 조사한 결과 각 절편은 비교적 넓은 범위의 항균 활성을 가지고 있었으며, 라이소자임 (Uu-ilys-α1-4, HEWL)과 시너지효과를 가지고 있었다. 두번쨰 물질인 저분자 유기물을 액체크로마토그래피 이중질량분석법과 분자질량을 토대로 한 구조식 데이터인 SmartFormula와 MetFrag를 사용하여 분석한 결과, 이 저분자 유기물은 4 종류의 구조식을 가질 수 있을 것으로 예상되었다. 제2장은 모시조개로부터 정제된 두가지 항균성 물질(항균성 펩타이드와 항균성 단백질)의 동정, 구조, 그리고 활성을 보고하고 있다. 모시조개의 헤모림프로부터 정제된 항균성 펩타이드는 6개의 Cys과 다량의 산성아미노산을 함유한 음이온성 성질을 띄는 펩타이드로 밝혀졌다. 전체적인 유전자 서열분석을 하기 위해서 cDNA cloning을 한 결과, 이 항균성 펩타이드는 총 136개의 아미노산으로 구성된 전구체를 가지고 있으며, 그 서열에는 15잔기의 아미노산으로 구성된 signal peptide, 86 잔기의 아미노산으로 구성된 중간영역 (2개의 dibasic amino acids 부위 포함) 및 35개의 아미노산으로 구성된 mature form을 포함한다. Mature form의 일차구조는 지금까지 밝혀진 물질들과 상동성을 조사한 결과 새로운 펩타이드로 판명되었지만, 시스테인 잔기를 포함하는 일부 서열이 defensin의 서열과 일부 유사하였기에 편의상 이 항균성 펩타이드를 CsDLPa로 명명하였다. 이 음이온성 항균성 펩타이드를 재조합 단백질 생산기술을 사용하여 만들었으며, 항균 활성을 측정하였다. 흥미롭게도 이 CsDLPa는 아연의 존재 하에서 항균 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 CsDLPa가 아연과 같은 보결분자단과의 상호작용에 의해 항균 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 한편 모시조개 혈액으로부터 또 다른 하나의 항균성 단백질을 정제하였다. 이 단백질은 여러 단계의 이온교환과 역상 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제하였으며, 분자량은 약 14 kDa이었다. 이 단백질은 아미노산 서열 분석법에 의해 부분적으로 25개의 아미노산 잔기까지 분석되었다. 이 서열을 NCBI BLAST를 통하여 분석한 결과, Meretrix meretrix에서 존재하는 단백질과 높은 상동성을 나타내었다. 전체적인 유전자 서열분석을 위해 cDNA cloning을 진행한 결과, 이 항균성 단백질은 155개의 아미노산 잔기로 구성되어 있었다. 이 중에서 N-말단의 18개의 아미노산 잔기는 signal peptide였으며, 계속해서 5개의 아미노산 잔기로 구성된 중간영역이 존재하였고, mature form은 132개 아미노산 잔기로 구성되어 있었다. 이 단백질은 재조합 단백질로 생산하였으며, 항균 활성을 체크하였다. 마지막으로 제3장에서는 메기로부터 정제한 항균성 펩타이드의 동정, 구조분석 및 작용 메커니즘에 대해 나타내었다. 메기 유래의 항균성 펩타이드의 일차구조는 메기에 존재하는 60S 리보좀 단백질 L27의 C-말단의 서열과 일치하였다. 이 물질을 화학적으로 합성하여 항균 활성을 측정한 결과, 그람 양성균 및 음성균에 대해 강력한 항균활성을 나타내었으며 대조군으로 사용한 항균성 펩타이드인, piscidin I과 유사한 항균 활성을 나타내었다. 또한, 이 펩타이드와 천연(세균) 및 인공막과의 상호작용을 조사하기 위하여 NPN 및 ONPG 실험과 lipid titration 및 소광실험을 하였다. 우선 E. coli ML35를 사용하여 NPN, ONPG 실험을 한 결과, 이 펩타이드는 세균의 외막과 내막에 상호작용한다는 것이 밝혀졌다. 중성지질인 DOPC와 산성지질인 DOPC/DOPG(3:1)로 구성된 인공막을 사용하여 lipid titration과 소광실험을 한 결과, 이 펩타이드는 중성지질 리포솜보다는 산성(DOPC/DOPG) 인공 지질막에 대해 더 잘 상호작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 막과의 상호작용에 대한 결과들을 종합해보면, 메기 유래의 항균성 펩타이드는 천연막과 인공막 모두에 작용을 하였으며, 이는 이 펩타이드가 막과의 상호작용을 통하여 세균을 파괴하는 메커니즘을 이용할 수도 있다는 것을 의미한다. 종합적으로 본 연구에서 개불, 모시조개 및 메기로부터 유래된 다양한 항균성 물질들 (저분자 유기물질, 항균성 펩타이드, 항균성 단백질)을 정제하여 생화학적 특성을 연구하였다. 이들 물질들은 해양생물의 생체내에서 세균 또는 바이러스와 같은 이물질의 침입에 대해 생체방어를 위한 선천성 면역반응에 관여하는 것으로 여겨진다. 이러한 항균성 물질의 기초적인 연구는 차세대 펩타이드성 항균성 물질의 선도물질로의 개발 또는 의약품 개발을 위한 후보제로의 유용한 기초자료로 활용 가능하다고 생각된다.

Marine organisms, unlike terristerial organisms, live in diverse and sometimes extreme environments such as environments with high pressuere and high salt concentrations. This leads to development of diverse biologically active molecules that have been discovered from these organisms. Aquatic animals including spoon worm, clam, and catfish are also exposed to extreme conditions and microbe-rich environments, and they are expected to produce and utilize diverse biologically active molecules. This study reports the identification and biochemical characterization of antimicrobial compounds from spoon worm (Urechis unicinctus), clam (Cyclina sienensis), and catfish (Silurus asotus). Chapter one reports the structure and the activitiy of two antimicrobial compounds (an invertebrate-type lysozyme and an organic compound with small molecular weight) isolated from spoon worm. The invertebrate-type (i-type) lysozyme, Uu-ilys, was produced through heterologous expression system, which exerted broad-spectrum antibacterial activity against gram-positive and gram–negative bacteria. However, recombinant Uu-ilys exerted comparatively weak enzymatic activity. These results suggest that the antimicrobial activity of i-type lysozymes may be exerted through non-enzymatic mechanisms. Three peptide candidates, which are expected to exert antimicrobial activity, were found through in silico prediction: Uu-ilys-α5, Uu-ilys-α5-6, and Uu-ilys-α6. These three peptides were produced through prokaryotic expression system. These peptides were active towards a broad-spectrum of bacteria and had synergistic effect when treated with Uu-ilys-α1-4 and HEWL. The analysis of the organic compound with small molecular weight (Uu280) using LC-MS/MS and formula prediction tools like SmartFormula and MetFrag revealed that Uu280 could have four formula candidates. Chapter two reports the identification, structure analyses, and activity of two antimicrobial compounds (an antimicrobial peptide and an antimicrobial protein). The antimicrobial peptide, CsDLPa, isolated from hemolymph of clam (C. sinensis) is an anionic peptide possessing six cysteine residues and a number of acidic residues. The full nucleotide obtained through cDNA cloning revealed that CsDLPa’s precursor has 136 amino acids (AAs); it comprised a signal peptide of 15 AAs, prosegement of 86 AAs, and a mature form of 35 AAs. CsDLPa was produced through recombinant protein production and then it’s antibacterial activity was measured. Interestingly, CsDLPa was only active when zinc ion was present. This result suggest that CsDLPa exerts it’s antibacterial activity through interaction with cofactors like zinc ion. The antimicrobial protein, CsVa3, was isolated through a series of ion-exchange and reverse pahsed high performance liquid chromatography. The measured molecular weight of this protein was 14 kDa and a partial sequence of 25 AAs was obtained. NCBI BLASR search of the AA sequence revealed that CsVa3 was highly similar to an uncharacterized protein from Meretrix meretrix. The full nucleotide sequence obatinaed through cDNA cloning showed that CsVa3 was composed of 155 AAs of which 18 AAs were signal peptide, 5 AAs were prosegment, and 132 AAs were the mature form. CsVa3 was produced as recombinant protein and it’s antimicrobial activity was measured. Chapter three reports the identification, structure analyses, the mechanism studies of an antimicrobial peptide (SaRpAMP) isolated from catfish (S. asotus). The AA sequence of SaRpAMP was identical to the C-terminal region sequence of 60S ribosomal protein L27. SaRpAMP showed strong antimicrobial activity, which was comparable to that of piscidin I, against gram-positive and gram-negative bacteria. Morever, ONPG and NPN uptake assay revealed that SaRpAMP interacted with the inner and the outer membranes of Escherichia coli ML35. SaRpAMP interacted with acidic liposome (DOPC/DOPG, 3:1) as well. These results suggest that SaRpAMP may utilize the interaction with the bacterial membranes in destroying the bacterial cells. Collectively, this study reports isolation, identification, and biochemical characterization of various antimicrobial compounds. These compounds may be involved in the innate immunity defending the organisms from pathogenic invasions. This study could provide insight into the innate immunity of aquatic organisms and study on thse antimicrobial compounds may lead to development of pharmaceutics.