In vitro steroid production in maturing oocyte of longchin goby (Chasmichthys dolichognathus) after exposure to organic UV filters

Abstract

Organic UV filters including 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone (BP-3) and 2-ethyl-hexyl-4-methoxycinnamate (EHMC) are widely used to protect skin or products from damage by UV irradiation. Although BP-3 and EHMC have been known as endocrine disruptor and frequently detected in aquatic animal and their habitats, limited information is available about adverse effects of EHMC and BP-3 on aquatic animals especially, marine fish. Therefore, we investigated the effects of BP-3 and EHMC on steroidogenesis in maturing oocytes of longchin goby (Chasmichthys dolichognathus). In experiment 1, the oocytes with average diameters of 0.77±0.02, 0.82±0.02 and 0.87±0.01 mm were incubated with EHMC (0.5, 5, 50 and 500 ng mL⁻¹) and/or BP-3 (0.5, 5, 50 and 500 ng mL⁻¹) for 24 h in the presence of 17α-Hydroxypregn-4-ene-3,20-dione,[1,2,6,7-³H] ([³H] 17αP). Steroid metabolites from [³H] 17αP were analyzed by thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). The metabolites were androgens [androstenedione (A4) and testosterone (T)], estrogens [estradiol-17β (E2) and estrone (E1)] and progestins [17,20β-Dihydroxy-4-pregnen-3-one (17α20βP)]. BP-3 (0.5, 50 and 500 ng mL⁻¹) and EHMC (0.5, 5, 50 and 500 ng mL⁻¹) in 0.77 mm and EHMC (5 and 500 ng mL⁻¹) in 0.82 mm oocytes increased the metabolic rate of E2 compared to the control but the increase was statistically insignificant. E2 metabolic rates of BP-3 and EHMC of 0.5 and 5 ng mL⁻¹ in 0.87 mm oocytes were higher than control and particularly, E2 rates were significantly increased in BP-3 5 ng mL⁻¹ (p<0.05). Decreasing trends of 17α20βP rates due to BP-3 and EHMC exposure were observed in 0.87 mm oocytes. In experiment 2, 0.82±0.02 mm oocytes were exposed to BP-3 (0.5, 5 and 50 ng mL⁻¹) with or without 17α20βP (50 ng mL⁻¹). After incubation for 24 hours, the T, E2 and E1 levels in media were measured by radioimmunoassay (RIA). BP-3 (50 ng mL⁻¹) +17α20βP increased the E2 level compared to +17α20βP control. BP-3 (0.5, 5, and 50ng mL⁻¹) +17α20βP increased E1 levels in a dose-dependent manner, and significant results were observed in BP-3 50ng mL⁻¹ +17α20βP compared to +17α20βP control (p <0.05). Our results suggest that metabolism of sex steroids can be altered by UV filters, and further studies related to this on reproductive endocrine disruption in marine fish are required.

유기 자외선 차단제인 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone (BP-3)와 2-ethyl-hexyl-4-methoxycinnamate (EHMC)는 자외선으로부터 피부 또는 제품을 보호하는 용도로 사용되는 물질이며, 수생생물의 서식처에서 빈번하게 검출된다. 하지만 수생동물 특히, 해산어에서 자외선 차단제의 유해성 평가에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 BP-3와 EHMC가 점망둑의 성숙기 난모세포의 성 스테로이드 생성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 실험 1에서는 전구물질인 17α-Hydroxypregn-4-ene-3,20-dione,[1,2,6,7-³H] ([³H] 17αP)로부터 생성되는 스테로이드 대사물질을 조사하기 위하여, 성숙기로 추정되는 평균 난경 0.77±0.02, 0.82±0.02와 0.87±0.01 mm 난모세포를 BP-3 또는 EHMC 0.5, 5, 50그리고 500 ng mL⁻¹ 에 24시간 동안 배양시켰다. 난모세포에서 대사된 androgens [androstenedione (A4), testosterone (T)], estrogens [estradiol-17β (E2), estrone (E1)] 그리고progestins [17,20β-Dihydroxy-4-pregnen-3-one (17α20βP)]는 thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC) 그리고 gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS)에 의해 확인되었다. BP-3 (0.5, 50그리고 500 ng mL⁻¹)와 EHMC (0.5, 5, 50 그리고 500 ng mL⁻¹)에 노출된 0.77 mm 그리고 EHMC (5그리고 500 ng mL⁻¹)에 노출된0.82 mm의 난모세포에서 E2로의 대사는 대조구에 비해 촉진되는 경향을 보였으나 유의한 차이는 없었다. 반면 0.87 mm 에서는 상대적으로 저농도인 0.5와 5 ng mL⁻¹ 의 BP-3와 EHMC가 E2로의 대사를 촉진시켰으며, 특히 BP-3의 5 ng mL⁻¹ 농도에서는 대조구에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (p<0.05). 0.87 mm 에서 BP-3 또는 EHMC 노출이 난모세포 최종성숙을 유도하는 17α20βP로의 대사를 억제시키는 것으로 관찰되었으나 유의한 차이는 보이지 않았다. 실험 2에서는 평균 난경0.82±0.02 mm을 대상으로 BP-3 (0.5, 5, 50 ng mL⁻¹) +17α20βP (50 ng mL⁻¹) 실험구를 설정하였다. 24시간 배양 후, 배양액으로 부터 T, E2 그리고 E1 농도를 RIA로 측정하였다. BP-3 (50ng mL⁻¹) +17α20βP 실험구에서 E2 농도가 증가하였으나 대조구 (+17α20βP)에 비해 뚜렷한 차이는 없었다. E1 농도는 BP-3 (0.5, 5 그리고 50ng mL⁻¹) +17α20βP 에서 증가하는 경향을 보였으나, BP-3 (50ng mL⁻¹) +17α20βP 실험구에서만 대조구 (+17α20βP)에 비해 유의한 차이를 보였다 (p<0.05). 본 결과는 자외선 차단제에 의해 점망둑의 성 스테로이드 대사가 교란될 수 있음을 제시하며, 이와 관련된 후속연구가 필요한 것으로 판단된다.