Identification and Characterization of Cyclic-di-GMP-specific Phosphodiesterase in Zymomonas mobilis

Abstract

Zymomonas mobilis는 목질계 원료를 활용한 연료 에탄올 생산 공정에 유용한 산업적 발효 균주로 연구되어왔다. 이전 연구를 통해 분리된 세포 응집 특성을 가진 Z. mobilis ZM401 균주는 에탄올 생산에 중요한 특성인 에탄올 및 발효 저해 물질에 대한 높은 내성을 가진다고 보고되었다. 이러한 이유로, 세포 응집 균주 ZM401에 대한 세포 응집 관여 인자를 규명하기 위해 transcriptomic microarray 및 genome sequencing 분석이 이루어졌으며 그 결과는 세포 응집 균주 ZM401의 ZMO1055 EAL 도메인에 암호화된 phosphodiesterase(PDE)에 발생한 단일 점 돌연변이(A526V)가 세포 응집의 주요 원인 중 하나임을 암시하였다. PDE는 박테리아 2차 신호 전달 물질인 c-di-GMP의 세포 내 수준을 조절함으로써 세포 응집에 관여하는 주요 단백질로 알려져있다. 따라서, 본 연구에서는 c-di-GMP 합성 및 분해에 관여하는 유전자의 발현 정도를 규명하고 heterologous expression을 통해 획득한 ZMO1055 PDE의 효소 기능 및 해당 단백질의 단일 점 돌연변이(A526V) 영향을 분석하였다. qRT-PCR 분석 결과, 세포 응집 균주 ZM401의 ZMO1055 유전자를 포함한 c-di-GMP 합성 및 분해에 관여하는 5 개의 유전자가 모 균주 ZM4에서 보다 2-3 배 상향 조절됨을 확인하였다. PDE 효소 분석은 세포 응집 돌연변이 균주 ZM401의 세포 내 총 PDEs 및 정제된 ZMO1055 PDE가 모 균주 ZM4의 해당 단백질보다 각각 0.8 및 0.75 배 낮은 가수 분해 활성을 가짐을 확인하였다. 이러한 결과는 세포 응집 균주 ZM401의 ZMO1055 EAL 도메인에 발생한 점 돌연변이(A526V)가 해당 균주의 PDE 활성 감소에 영향을 미침으로써 c-di-GMP의 세포 내 수준이 모 균주 ZM4에서보다 높게 유지되는 것과 관련 있음을 시사하였다. 또한, ZMO1055 EAL 도메인 서열 비교 및 2차 구조 분석으로 ZMO1055 EAL 도메인의 점 돌연변이가 α13 나선의 하나의 아미노산 잔기를 대체하며 해당 아미노산을 포함하는 α13 나선이 PDE 이량체 형성에 관여함을 확인하였다. PDE의 이량체 형성은 EAL 도메인의 c-di-GMP 결합 부위인 DDFGTG(YSS)모티프의 나선 루프의 확장 및 안정화와 관련하여 해당 모티프를 활성 형태로 유도하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로, 이 연구는 ZMO1055 PDE가 c-di-GMP의 조절에 관여하는 주요 기능 효소이며, ZMO1055 PDE의 효소적 활성은 이합체 형성을 통한 c-di-GMP 결합 부위의 활성 유도에 의해 결정된다는 것을 제시한다.

Zymomonas mobilis has been known as a promising ethanologen used in fuel ethanol production process using lignocellulosic materials. The cell flocculation mutant strain Z. mobilis ZM401 with self-immobilization phenotype has been previously isolated via conventional chemical mutagenesis. This strain showed several important industrial robustness characteristics for ethanol production. With this reason, further studies on this flocculent strain with transcriptomic microarray and genome sequencing analysis have been carried out, and the results suggested that a single point mutation (A526V) in a putative phosphodiesterase(PDE) encoded by ZMO1055 EAL domain is one of the main causes for the cell flocculation characteristics. The PDE was predicted as one of major proteins involved in cell flocculation by controlling the intracellular levels of c-di-GMP, one of the bacterial second messengers. Therefore, this study investigated the expression levels of genes involved in the c-di-GMP synthesis/degradation, its enzymatic function and activities associated with the effect of the single point mutation on the ZMO1055 PDE via heterologous expression of this protein in Escherichia coli. The qRT-PCR analysis showed that five genes involved in c-di-GMP synthesis/degradation including ZMO1055 from ZM401 were 2-3 times up-regulated as compared to those from ZM4. The PDE enzyme assay indicated that total PDE activities of crude extracts from ZM401 and purified ZMO1055 PDE of ZM401 showed 0.8- and 0.75-times lower hydrolytic activities than those of ZM4. These results suggest that the point mutation (A526V) in the ZMO1055 EAL domain of ZM401 influenced lowing the PDE activities in the flocculent strain ZM401 resulting in maintaining the higher intracellular level of c-di-GMP than that in the planktonic strain ZM4. In addition, the sequence and domain analysis of ZMO1055 confirmed that the point mutation (A526V) in α13 helix of ZMO1055 EAL domain is likely to be involved in PDE dimer formation. The dimerization of PDE plausibly induces the c-di-GMP binding site to be in less active form by expanding and stabilizing the helix loop of the DDFGTG(YSS) motif, the c-di-GMP binding site of the EAL domain. Consequently, this study indicated that ZMO1055 phosphodiesterase is a key enzyme involved in the regulation of c-di-GMP levels, and its enzyme function was potentially determined by induction of active form of the c-di-GMP binding site through dimerization of PDE.