Optimization of microalgae transformation system for recombinant vaccine production

Abstract

Escherichia coli has been used as the primary system for the production of recombinant proteins. However, the production of functional protein in E. coli has some limitation such as the lack of post-translational modification. Microalgae expression system is a eukaryotic system with the post-translational modification and can be an alternative way of the bacterial system. Furthermore, the microalgae system has diverse advantages such as high protein folding accuracy, high yield, and low cost for culture. Despite many advantages of microalgae over bacterial expression system, it has other limitation such as natural resistance to many antibiotics that used as selection of transformed cell. In this study, we developed an efficient method to select transformed microalgae based on knock-out of nitrate reductase gene (NR) using the homologous recombination technique. Transformants were successfully selected on a plate containing 200 mM of KClO3 under dark condition and integration of the target gene and expression of the recombinant protein were confirmed by PCR and Western blot, respectively. In order to test the microalgae expression system, we expressed the glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV). VHSV is a pathogenic agent causing viral hemorrhagic septicemia disease (VHSD) in fish farms around the world for which effective vaccines have not been developed. The expression of the VHSV G protein in transformed Chlorella cell was confirmed by western blot analysis. Feeding of the transformed Chlorella by mixing the microalgae with regular feed induced the production of antibody against VHSV, and the protective effect was proved by challenge test with VHSV. This result indicates that transformed microalgae can be used an efficient system for the production of recombinant proteins such as vaccine and therapeutic proteins.

대장균에서 재조합 단백질 생산은 주요 시스템으로 사용되어왔다. 그러나 대장균에서는 기능성 단백질 생산에 있어 변역 후 변형이 원활이 이루어지지 않는것과 같은 몇 가지 제한을 가진다. 미세조류 발현 시스템은 변역 후 변형이 이루어지는 진핵세포 시스템으로 원핵세포 발현 시스템의 대안으로 사용될 수 있다. 또한, 미세조류 시스템은 고 단백질 접힘 정확도, 높은 수율 및 낮은 배양 비용과 같은 다양한 이점을 갖는다. 미세조류는 박테리아 발현 시스템에 비해 많은 장점을 가짐에도 불구하고, 형질전환체의 선별을 위해 사용되는 항생제에대한 자연 내성을 지닌다는 한계를 가진다. 본 연구에서는, 상동 재조합 기술을 이용하여 질산염 환원 효소 유전자를 제거하여 형질전환 된 미세 조류를 선별하는 효율적인 방법을 개발 하였다. 형질전환체는 암 조건에서 200 mM의 염소산칼륨을 함유하는 선별 배지에서 성공적으로 선별되었고, 표적 유전자의 통합 및 재조합 단백질의 발현을 중합효소 연쇄 반응 및 웨스턴 블랏을 통하여 확인 하였다. 미세 조류 발현 시스템을 시험하기 위해 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 당 단백질을 발현 하였다. 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스는 전세계 양식장에서 바이러스 출혈성 패혈증을 일으키는 병원성 바이러스이며 현재까지 효과적인 백신이 개발되지 않았다. 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 당 단백질이 웨스턴 블랏 분석에 의해 형질전환 된 미세조류에서 발현이 되었음을 확인하였다. 미세 조류와 어류 표준 사료를 혼합하여 넙치에 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 항체 생산을 유도하였고, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 의한 항원 검사로 보호 효과를 입증 하였다. 이 결과는 형질 전환 된 미세 조류가 백신 및 치료 용 단백질과 같은 재조합 단백질의 생산을 위한 효율적인 시스템으로 사용될 수 있음을 나타낸다.