송사리 난소 생식선 줄기세포의 분리 및 배양기술 개발

Abstract

어류 난소 생식선 줄기세포는 자가증식능 및 배우자 형성능을 가진 생식선 줄기세포의 하나로 정소 생식선 줄기세포와 마찬가지로 형질전환동물 생산, 발생 및 유전학적 연구, 멸종위기종의 복원 등에 유용하게 활용될 수 있으나, 정소 생식선 줄기세포에 비해 상대적으로 적은 연구가 보고되어 있다. 난소 생식선 줄기세포의 활용을 위해서는 이들의 적정 분리 방법 및 적정 체외배양조건에 대한 연구가 선행될 필요가 있으며, 따라서 본 연구에서는 생물학적 모델 어류인 송사리(Oryzias latipes)의 난소 생식선 줄기세포 분리 및 배양조건에 대해 조사하였다. 난소 생식선 줄기세포는 난소 조직을 구성하는 전체 세포 중 적은 비중을 차지하므로 우선적으로 보다 높은 순도로 난소 생식선 줄기세포를 분리할 수 있는 조건을 탐색하고자 하였으며, 이를 위해 난소 조직으로부터 회수한 세포를 Percoll 밀도기울기 원심분리 및 부착/비부착세포 선별을 단독 또는 조합 처리하였다. 각 방법에 의해 분리된 세포들에 대해 세포형태, 생식선 줄기세포 특이적 유전자의 발현량 및 자어 생식소 내 이식세포 집락 형성을 분석하였으며, 이를 통해 적정 분리 조건을 선정하였다. 연구 결과, 난소 생식선 줄기세포의 분리에 있어 Percoll 밀도기울기 원심분리의 경우, 20-40%의 밀도층으로부터 세포를 회수하는 것이 효과적이었으며, 부착/비부착세포 선별의 경우, Matrigel이 처리된 배양접시에서 배양 후 비부착 세포를 회수하는 것이 효과적이었다. 또한, 두가지 분리방법을 조합 사용한 경우, 이들을 단독 사용한 경우에 비해 높은 순도로 난소 생식선 줄기세포를 확보할 수 있었다. 선정된 조건에 의해 분리된 난소 생식선 줄기세포의 부착, 생존, 증식 및 세포특성유지에 효과적인 배양조건을 확립하기 위해 poly-dopamine 또는 poly-L-lysine이 코팅된 배양접시에서 배양하거나, 배아유래 영양세포주와 공배양하였다. 영양세포주와의 공배양 실험에서는 성장인자 유전자 4종(Ffg2, Gdnf, Gsdf 및 Lif)을 과발현시킨 세포주를 확립하여 활용하였다. 배양조건의 적정성을 평가하기 위해 난소 생식선 줄기세포의 부착, 집락 형성, 증식, 생식선 줄기세포 특이적 유전자발현 및 자어 생식소 내 이식세포 집락 형성을 분석하였다. 배양 실험 결과, poly-dopamine 또는 poly-L-lysine이 처리된 배양접시에서 난소 생식선 줄기세포를 배양한 결과, 비처리 또는 poly-L-lysine 처리된 배양접시에 비해 poly-dopamine 처리된 배양접시가 난소 생식선 줄기세포의 체외 배양시, 세포의 부착, 집락 형성, 생존 또는 특성 유지에 있어 지지 효과가 있는 것으로 나타났고, 영양세포주는 비처리된 배양접시에 비해 난소 생식선 줄기세포의 집락 형성 및 성장을 지지하는 것으로 나타났다. 본 연구의 결과는 어류 난소 생식선 줄기세포의 확보 및 체외조작을 위한 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 생각되며, 궁극적으로 어류 난소 생식선 줄기세포에 대한 연구 및 산업적 목적으로의 활용에 있어 기여할 수 있을 것으로 기대된다.