초임계 이산화탄소를 이용하여 세신에서 추출한 생리활성 오일의 기능적 특성

Abstract

Asari Radix et Rhizome is the root of Asiasarum heterotropoides var. mandshuricum. The essential oil of Asari Radix et Rhizome (A. Radix oil) has been traditionally used pharmacologically to Korea peninsula, Japan and China. Many types of pharmacological studies have shown that A. Radix oil has different biological activities including, anti-tumor, antimicrobial, antioxidant, anti-inflammatory, and larvicidal activities owing to its high amount of methyleugenol and other pharmacologically active phytochemicals. However, there is currently no information about the potential of A. Radix oil to modulate human body odor-producing bacteria and the physicochemical properties and the volatile organic compounds (VOCs) along with their deodorant activity of the oil. Moreover, though a lot of works have been conducted in the extraction of oils from A. Radix oil using organic solvents and hydro distillations, information about extraction using SC-CO2 is very few and to the best of our knowledge, there is no reported data on using co-solvents with SC-CO2. Therefore, the aim of this study was to extract oil from A. Radix oil using neat SC-CO2 and modified SC-CO2 at different conditions and compare with other organic solvent extraction to achieve pharmaceutically more active oils. Moreover, methyeugenol and safrole content of the oil were evaluated due to their pharmacological importance and toxicity. In the first study, oil was extracted from A. Radix supercritical carbon dioxide (SC-CO2) with and without ethanol as co-solvent and the result was compared with conventional extraction solvents. In additional to the physicochemical properties, their antioxidant activities along with antimicrobial and inhibitory activities against five human body odor producing bacteria (Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium freudenreichii, Micrococcus luteus, Corynebacterium jeikeium, and Corynebacterium xerosis) and deodorant efficiency against ammonia were evaluated. The oil was found to contain 15 components, among which the most abundant component was methyl eugenol (37.6%), which was identified at every condition studied in different extraction methods. The solvent SC-CO2+ ethanol at 250 bar/50°C, 200bar/50°Cwas found to be the best condition to get high yield of oil relative to crude lipid with 98.6%, 96.2% respectively. A total of 27 major volatile organic compounds (VOCs) were identified among them eucarvone, 3-carene, safrole, methyleugenol, and camphene were found to be the highest. The oil extracted with n-hexane and ethanol mixture exhibited a strong antioxidant activity (92% ± 2%) and the highest ABTS and DPPH scavenging activities (89% ± 0.2%). The highest amounts of total phenolic content and total flavonoid content were 23.1 ± 0.4 mg/g and 4.9 ± 0.1 mg/g, respectively, in the conventional extraction method. In the SC-CO2 method performed at 200 bar/50°C as an entrainer, the highest inhibition zone was recorded against all the aforementioned bacteria. In particular, strong antibacterial activity (38 ± 2 mm) was found against M. luteus. The minimum inhibitory concentration (MIC) for the oil against bacteria ranged from 10.1 ± 0.1 µg/mL to 46 ± 2 µg/mL. The lowest MIC was found against M. luteus. The extracted oil 200 bar/50°C using ethanol showed 100% of deodorant efficiency within 30 min of reaction with an artificially manufactured odorant. This study showed that the oil extracted with SC-CO2 + ethanol as a solvent at 200 bar/50°Chas an optimum condition satisfying all conditions in which the content of safrole is low and the content of methyleugenol, yield, antibacterial activity, deodorizing ability are high. In the second study, oil was extracted from Asari Radix et Rhizome using supercritical carbon dioxide (SC-CO2) with ethanol. Then, to protect the loss of antimicrobial activity and to prevent oxidation, the extracted oil was encapsulated using Polycaprolactone (PCL) by particles from gas-saturated solutions (PGSS) process. The encapsulation was performed at temperature of (T, 40–50°C), pressure (P, 200–300 bar) and polymer-oil ratios (R, 5:1–10:1 g/g). Response surface methodology (RSM) was employed to optimize process parameters that affect the encapsulation of methyleugenol. The optimal encapsulation conditions were found to be (T, 44.75°C, P, 256.4 bar and R, 7.22:1 g/g) with 15.64±0.11mg/g of ME. The encapsulated oil has less effectiveness on odor pathogens. In the third study, Asari Radix et Rhizome oil is commonly used in cosmetic products. The cytotoxicity and skin sensitivity are studied to investigate the feasibility of using Asari Radix et Rhizome oil extracted under optimum conditions as an antibacterial and deodorizing agent Cytotoxicity testing and an ex vivo local lymph node 5-bromo-2-deoxyuridine (LLNA-BrdU) assays were performed to determine the dermal sensitization potential of A. Radix oil. The cyto¬toxicity assay indicated inhibitory effects on cell via¬bility in a human forearm skin fibroblast cell line after 24-h incubation at concentrations of A. Radix oil above 50 µg/mL. To assess skin sensitization, A. Radix oil (10%, 25%, and 50% v/v) were applied to the ears (dorsal surface) of female CBA mice. Changes in clinical signs, body weight, skin reac¬tions, ear thickness, skin stimulation index (SI), and mortality were evaluated. No changes in treatment-related clinical signs, skin reactions, erythema, body weight, or mortality were observed in any treatment group. The results of the ex vivo LLNA-BrdU assays yielded SI of 1.6. For the 10%, 25%, and 50% (v/v) treatment groups, SIs were calculated as 0.9, 1.2, and 2.1, respectively. Thus, this study showed that at concentrations below 25% (v/v), A. Radix oil was not skin sensitizing. Furthermore if A. Radix oil is used under MIC 46 ± 2 µg/mL it would be safe on the skin. Overall, this study showed that carbon dioxide (SC-CO2) with ethanol as co-solvent technology enables to extract a small amount of safrole which can satisfy the regulation condition of the safrole and a high in antioxidant, antimicrobial and deodorant component to A. Radix oil, So this technology could be employed for extraction of A. Radix oil that can be used in biomaterial of deodorant and antibacterial related industries.

세신(Asari Radix et Rhizome)은 메틸유제놀을 다량 함유하는 쥐울덩굴과의 족두리풀(Asiasarum heterotropoides var. mandshuricum )의 뿌리를 말려서 말린 약재이다. Asari Radix et Rhizome (세신)의 에센셜 오일은 전통적으로 한반도, 일본 및 중국에 약리학적으로 사용되어 왔다. 많은 종류의 약리학 연구에서 세신 오일은 다량의 methyleugenol 및 다양한 약리학적 화학성분으로 인해 항종양, 항균, 항산화, 항염증제 및 유충제 활성을 비롯한 다양한 생물학적 활성을 가지고 있음을 알려지고 있다. 그러나, 유기 용제 및 수증기 증류법을 사용하여 세신에서 오일을 추출하는 데 많은 연구가 수행되었지만 SC-CO2를 사용하는 추출 및 이에 따른 물리 화학적 성질 및 휘발성 유기 화합물(VOCs)에 대한 정보는 거의 없으며 특히 SC-CO2와 함께 보조용매를 사용하여 추출한 정보는 현재까지 없다. 또한, 현재 세신 오일이 인체 냄새 생성 박테리아을 조절하는 잠재력과 소취 활성에 대한 연구가 수행된 적이 없다. 따라서 본 연구의 목적은 세신을 초임계 이산화탄소(SC- CO2)와 에탄올의 보조용매로 추출오일과 유기 용매 추출 오일을 비교하여 생리활성이 뛰어난 오일을 회수하는데 목적이 있다. 또한, 약리학적 중요성과 독성으로 인해 오일내의 methyeugenol과 safrole 함량을 평가하였다. 첫번째 연구에서는 보조용매로서 에탄올 유무에 따른 초임계 추출법을 사용하여 추출한 오일과 유기용매로 추출한 오일을 비교하는 것을 목표로 하였다. 물리화학적 특징뿐만 아니라 5가지 체취 원인균(S.epidermidis, P.Freudenreichii, M.icrococcus luteus C. jeikeium, C. xerosis)에 대한 항균 및 암모니아 소취에 대해 평가하였다. 추출오일에는 15종의 성분을 함유하고 있고 methyleugenol(37.6%)이 가장 많았고 SC-CO2 + ethanol용매의 250bar 50°C, 200bar 50°C에서 각각 98.6%, 96.2% 로 회수율이 높았다. eucarvone, 3-carene, safrole, methyleugenol, camphene 를 공통으로 포함하는27 가지 주요 휘발성 유기 화합물 (VOCs)이 확인되었다. 유기용매 추출에서 TPC와 TFC는 각각 23.1 ± 0.4 mg / g 및 4.9 ± 0.1 mg / g 이었으며 오일의 ABTS 소거능(92 % ± 2 %) 및 DPPH 소거능(89 % ± 0.2 %)이 가장 높은 항산화 활성을 나타냈다. 산가와 과산화 물가가 안정되고 항산화기능도 높았다. 5 종의 체취 생성 박테리아에 대한 항균 및 저해 활성을 평가한 결과 SC-CO2을 용매로 200bar 50°C조건에서 모든 균에 대한 높은 저해활성이 나타났으며 특히, M. luteus에 대하여 강한 항균 활성(38 ± 2 mm)이 발견되었다. 최소 억제 농도(MIC)는 10.1 ± 0.1 µg / mL에서 46 ± 2 µg/mL /ml 의 범위였다. SC-CO2 + 에탄올을 용매로 200bar 50°C에서 추출한 오일은 인위적으로 제조된 냄새 물질과의 반응 30 분 이내에 100 %의 탈취 효율을 보였다. 이 연구의 결과 SC-CO2 + 에탄올을 용매로 200bar 50°C에 추출한 오일이 사프롤의 함량이 낮고 메틸유제놀의 함량, 수율, 항균활성, 소취능, 항산화능이 높아야하는 모든 조건을 만족시키는 최적 조건임을 알수 있었다. 두 번째 연구에서는 최적 조건으로 추출한 세신오일의 산화를 방지하고 항균 활성의 손실을 방지하기 위해 추출된 오일을 가스 포화 용액(PGSS) 공정에 의해 폴리 카프로 락톤(Polycaprolactone)을 사용하여 캡슐화하였다. 캡슐화조건은 온도(T, 40-50 °C), 압력(P, 200-300 bar) 및 중합체 - 오일 비 (R, 5 : 1-10 : 1 g / g)에서 수행되었다. Response surface methodology (RSM)는 methyleugenol (ME)의 캡슐화에 영향을 미치는 공정 매개 변수를 최적화하기 위해 사용되었다. PGSS을 이용한 회수된 입자 내 methyleugenol (ME)의 함량으로 분석한 RSM 결과 최적 캡슐화조건은 압력 256.47 bar, 온도 44.75°C, 혼합비율 7.22이며 ME 15.64 ± 0.11mg / g으로 나타났다. 체취원인균에 대한 항균 활성이 오일에 비해 낮게 나타났다. 세번째 연구에서는 최적조건에서 추출한 세신 오일의 항균, 소취 기능성 소재로 활용 가능성을 알아보기 위해 세포독성과 피부민감성에대해 연구하였다. 세포 독성 분석은 세신오일 50 µg / mL 이상의 농도에서 24 시간 인큐베이션 한 후 인간 팔뚝 피부 섬유 아세포 세포주에서 세포 생존 능력에 대한 억제 효과를 나타내었다. 피부민감성 평가는를 위해 암컷 CBA 생쥐의 귀 배면에 세신오일 (10 %, 25 %, 50 % v / v)을 도포한뒤 임상 징후, 체중, 피부 반응, 귀 두께, 피부 자극 지수 (SI) 및 사망률의 변화의 평가 및 생체 외 LLNA-BrdU 분석을 실시하였다. 모든 처치군에서 처치와 관련된 임상 징후, 피부 반응, 홍반, 체중 또는 사망률의 변화는 관찰되지 않았다. 생체 외 LLNA-BrdU 분석의 결과는 SI가 1.6이하로 확인되었다. 10 %, 25 % 및 50 % (v / v) 처리 그룹의 SI는 각각 0.9, 1.2 및 2.1로 계산되었다. 따라서, 25 % (v / v) 이하의 농도에서 세신오일은 피부자극이 없는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구를 통해 오일의 항균 MIC 농도 46 ± 2 µg / mL 로 사용할 경우 피부에 안전하게 사용할 수있는 것을 알 수 있었다. 따라서 SC- CO2+에탄올을 용매로한 추출법은 사프롤의 함량에 규제 조건을 만족시킬수 있는 적은 양의 safrole과 항균, 항산화, 소취기능이 높은 성분의 추출이 가능하여 환경 친화적인 기능성 세신 오일을개발하는데 유용한 기술로 사료된다.