Generation of recombinant NNV(nervous necrosis virus) using reverse genetics and its application

Abstract

본 논문에서 연구에 이용한 nervous necrosis virus (NNV)는 Betanodavirus 속에 속하며, single strand RNA virus이고 linear한 두 가닥의 genome을 지닌다. NNV는 다양한 어종에 감염되는 것으로 알려져 있으며, 본 연구에서는 NNV를 다양한 병원체에 대한 항원 전달 시스템으로 개발하기 위해 reverse genetics를 이용하여 재조합 NNV를 제작하였다 본 연구에서는 재조합 NNV를 제작하기 위해 red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV)의 full genome cDNA를 이용하였으며, CMV promoter를 사용하여 host cell의 RNA polymerase II를 이용하도록 design하였다. Viral genome의 5’-end에는 hammerhead ribozyme (HHR)을 넣었고 3’-end 쪽에는 Hepatitis delta virus ribozyme (HDVR)을 넣어 viral genome을 정확한 size와 sequence로 얻을 수 있도록 하였다. Nodavirus의 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP)를 coding하는 RNA1이 곤충세포를 포함한 다양한 cell-line에서 작동한다는 점을 이용하여, 포유류 세포인 baby hamster kidney cell (BHK-21)에 NNV RNA1과 RNA2를 각각 지니는 두 개의 plasmid를 transfection 한 뒤 freezing-thaw를 통해 lysate를 제작하였다. 그 뒤, 이 lysate를 NNV에 감수성을 지닌다고 알려진 cell-line인 E-11에 접종하였고 앞선 단계와 같은 방식으로 E-11의 lysate를 제작하였다. 각 단계에서 제작된 lysate를 ultracentrifugation하여 높은 농도의 virus 샘플을 제작하였으며, 투과전자현미경을 통해 3차원적 형태를 확인한 결과 그 크기와 모양이 NNV와 일치함을 확인하였다. 더 나아가 이렇게 제작된 재조합 NNV를 다른 병원체의 항원 단백질을 전달할 수 있는 시스템으로 개발하기 위해 SpyTag-SpyCatcher system을 이용하여 바이러스 표면에 reporter로서 EGFP를 부착시키고자 하였다. 이를 위해, 기존의 디자인에서 NNV RNA2의 3’ UTR 앞 부분에 linker와 SpyTag을 넣어준 plasmid를 제작하고, 이를 이용하여 SpyTag을 표면에 발현하는 재조합 NNV를 제작하였다. 바이러스 표면에 노출된 SpyTag에 reporter 단백질인 EGFP를 부착시키기 위해 pcDNA3.1 벡터 내에 EGFP와 SpyCatcher를 linker로 연결시킨 plasmid를 세포에 transfection하여 SptCatcher와 결합된 EGFP를 세포에 발현시켰으며, 끝으로 위 두종류의 세포 lysate를 함께 incubation하여 EGFP를 표면에 부착하고 있는 재조합 NNV를 제작하였다. 본 연구를 통해 제작된 재조합 NNV 시스템은 향후 복합백신 및 경구백신 개발에 도움을 줄 수 있을 것으로 여겨진다.