Hepatoprotective Mechanism of Meroterpenoid-Rich Fraction from the Ethanolic Extract of Sargassum macrocarpum
- Alternative Title
- 큰열매모자반 주정추출물로 제조된 메로테르페노이드 농축물의 간보호 기전
- Abstract
- 갈조류인 모자반은 다양한 대사산물로 인하여 광범위한 생물학적 활성을 지니는 것으로 보고되었으며 큰열매모자반(Sargassum macrocarpum, 톱니모자반이 2017년 큰열매모자반으로 재분류)은 강력한 항산화와 항염증 활성을 지닌 메로테르페노이드를 다량 함유하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 큰열매모자반을 다양한 용매로 추출하여 각각의 용매 추출물과 분리된 사가하이드로 퀴노익산, 사가퀴노익산 및 사가크로메놀의 항산화 활성을 측정 비교하였다. 큰열매모자반의 메로테르페노이드가 풍부한 주정 추출물 (MES)은 t-BHP로 산화적 손상을 유도한 HepG2세포와 ICR 마우스에서 간보호 효과와 그 기전을 규명하였다. 또한, MES로부터 분리한 사가하이드로퀴노익산은 t-BHP를 처리한 HepG2세포에서 Nrf2 경로를 통한 간세포 보호효과 및 그 기전에 대해 밝혔다.
여러 가지 용매를 이용하여 추출한 큰열매모자반 추출물의 항산화 활성을 분석한 결과, 에틸아세테이트, 에탄올 및 메탄올로 추출한 추출물은 다른 추출 용매와 비교하여 높은 총페놀 함량(TPC)을 나타내었다. 또한 추출물을 다양한 항산화 활성 분석법으로 측정한 결과, 에틸아세테이트, 에탄올 및 메탄올 추출물은 다른 추출물에 비해 상대적으로 높은 DPPH, ABTs 및 하이드록실 라디칼 소거능을 나타내었다. 헥산 추출물은 가장 높은 하이드록실 라디칼 소거능을 나타내었으며 에틸아세테이트 추출물은 가장 강력한 ROS소거능을 보였다. 분리된 사가하이드로퀴녹익산, 사가퀴노익산, 사가크로메놀은 큰열매모자반의 주요 항산화 활성성분임을 확인하였다. 추출용매 중 에탄올 추출물의 세가지 화합물 함량이 가장 높았으며, 세 화합물의 총 함량은 227 ± 6.31 mg/g으로 나타났다. 각 화합물의 항산화 활성을 측정 한 결과, 사가하이드로퀴노익산과 사가크로메놀은 ROS, DPPH, ABTs 및 수퍼옥사이드 라디칼 소거능에서 IC50값이 낮아 사가퀴노익산보다 더 강한 항산화능을 나타내었다. 그러므로, 큰열매모자반 추출물은 식품 산업에서 천연 항산화제로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
큰열매모자반 주정추출물(MES)의 간보호 효과를 t-BHP를 처리한 HepG2를 이용하여 측정하였다. MES는 t-BHP에 의한 산화적 손상으로부터 농도 의존적으로 세포 생존력을 회복시켰다. 그리고, MES는 t-BHP를 처리한 HepG2세포에서 생성되는 ROS와 지질 과산화물을 감소시켰으며, t-BHP에 의해 감소된 글루타치온 농도를 상승시켰다. 또한, SOD와 카탈라아제와 같은 항산화 효소는 t-BHP에 의해 유도되어 활성이 증가하였지만, MES에 의해 효소활성이 감소되었다. MES는 전사인자인 Nrf2의 핵으로 이동을 증가시킴으로써, 글루타치온 전이 효소 (GST)의 활성과 HO-1과 NQO1의 생성을 증가시켰다. 이러한 결과는 MES의 항산화 활성이 SOD와 카탈라아제의 활성을 대체하고, 해독과 관련된 제독효소의 생산을 유도하여, MES가 t-BHP에 의한 산화적 스트레스에 대하여 간 보호제로 사용될 수 있음을 보여주었다.
동물 모델을 이용하여 MES가 t-BHP로 산화적 손상이 유도된 ICR마우스에서 간보호 효과를 나타내는지에 대하여 연구하였다. t-BHT 처리는 AST, ALT, LDH 및 지질 과산화를 생성을 증가시킴으로써 간 손상을 유도하였다. MES 처리에 의해 AST, ALT, LDH 및 지질 과산화를 감소시켜 간보호 효과를 나타내었다. GSH 생성 및 GSH 생성관련 효소 활성을 분석한 결과, MES처리군은 t-BHP에 의해 유도되는 GSH의 감소와 GSH관련효소인 GST, GPx 및 GR 활성 감소를 억제하였다. MES는 글루탐산시스테인 합성효소 (GCL)의 서브유닛인 GCLC 및 GCLM의 발현을 증가시킴으로써 글루타치온 합성을 유도하였다. 또한, MES는 세포내 항산화 효소인 SOD 및 카탈라아제를 생성을 증가시켰다. 항산화 조절 메커니즘에서 MES는 핵으로 Nrf2의 이동을 유도하고 그 표적 단백질인 HO-1과 NQO1의 발현을 증가시켰다. 동물실험 결과, MES는 t-BHP 유도에 의한 간손상에 대하여 동물실험에서도 세포 실험과 같이 간보호 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 이러한 결과에서 간보호 제제로 이용 가능성이 있음을 확인 할 수 있었다.
SHQA는 큰열매모자반 주정추출물의 주성분 중의 하나이며, 항비만 효과나 색소의 과잉 침작에 대한 억제작용과 같은 특성이 있다. 본 연구에서 SHQA는 t-BHP를 처리한 HepG2 세포에서 ROS 생성 및 지질 과산화를 약화시켰다. 또한, t-BHP에 의한 글루타치온의 감소는 SHQA 및 실리마린 처리에서 GCLC 및 GCLM 발현 수준의 상향 조절에 의해 증가되었다. t-BHP에 의한 SOD 및 카탈라아제 활성의 증가는 SHQA에 의해서 감소하였다. SHQA는 Nrf2의 핵으로의 전이를 유도하고 p38 MAPK와 ERK MAPK의 인산화를 통해 HO-1 및 NQO1과 같은 제독효소의 발현을 증가시켰다. 추가적으로, SHQA는 p-GSK3β의 상향 조절을 통해 Fyn매개로 핵 내 Nrf2의 방출을 억제하였다. 이러한 결과는 t-BHP로 처리된 HepG2세포에서 SHQA에 의한 간보호 효과가 Nrf2활성화를 통한 항산화 및 제독 효소의 활성화를 조절한다는 것이 세포실험을 통하여 입증되었다.
- Issued Date
- 2019
- Awarded Date
- 2019. 8
- Type
- Dissertation
- Keyword
- 큰열매모자반
- Publisher
- 부경대학교
- Alternative Author(s)
- Sujin Lim
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 식품생명과학과
- Advisor
- 김형락
- Table Of Contents
- ChapterⅠ.Introduction 1
1.Biological activity of Sargassum macrocarpum 2
2.Oxidative stress and antioxidant 5
2.1.Oxidative stress 5
2.2.Antioxidant 6
3.Liver diseases 9
4.tert-Butyl hydroperoxide 10
5.Nrf2 pathway 12
6.Purpose of this study 15
ChapterⅡ.Evaluation of antioxidant activities of various solvent extracts and its major components from Sargassum macrocarpum 16
1.Introduction 17
2.Materials and methods 19
2.1.Reagents 19
2.2.Preparation of S. macrocarpum extract 19
2.3.HPLC chromatographic conditions 20
2.4.Validation of compounds by HPLC analysis 20
2.5.Determination of total phenolic content 22
2.6.DPPH radical scavenging activity 22
2.7.ABTs anion radical scavenging activity 23
2.8.Superoxide radical scavenging activity 23
2.9.Hydroxyl radical scavenging activity 24
2.10.Cell viability 24
2.11.Determination of ROS production 25
2.12.Statistical analysis 25
3.Results 26
3.1.Determination of TPC and yields in different solvent extracts 26
3.2.DPPH radical scavenging activity 26
3.3.ABTs radical scavenging activity 28
3.4.Superoxide radical scavenging activity 28
3.5.Hydroxyl radical scavenging activity 28
3.6.Intracellular ROS scavenging ability 30
3.7.Quantification of components 30
3.8.Quantification of active components in different solvent extracts 33
3.9.Antioxidant activities of isolated components 37
4.Discussion 39
5.Conclusions 42
ChapterⅢ.Meroterpenoid-rich fraction from the ethanolic extract of Sargassum macrocarpum suppressed oxidative stress induced by tert-butyl hydroperoxide in HepG2 cells 43
1.Introduction 44
2.Materials and methods 47
2.1.Materials 47
2.2.Preparation of MES and isolation of components 47
2.3.Cell culture and viability assay 48
2.4.Determination of ROS production 48
2.5.Measurement of lipid peroxidation 49
2.6.Determination of glutathione level 49
2.7.Measurement of antioxidant enzyme activities 50
2.8.Separation of nuclear and cytosolic extract 50
2.9.Western blotting 50
2.10.Immunofluorescence analysis 51
2.11.Statistical analysis 52
3.Results 53
3.1.Hepatoprotective effect of MES 53
3.2.Effect of MES on the inhibition of ROS production and lipid peroxidation 53
3.3.Effect of MES on the glutathione levels 56
3.4.Effect of MES on SOD and catalase activities 56
3.5.Effect of MES on GST activity and expression of HO-1 and NQO1 56
3.6.Effect of MES on Nrf2 expression and nuclear translocation 59
3.7.Identification of antioxidant components in MES 62
4.Discussion 64
5.Conclusions 66
ChapterⅣ.Protective effect of meroterpenoid-rich fraction from the ethanolic extract of Sargassum macrocarpum on tert-butyl hydroperoxde-induced mice 68
1.Introduction 69
2.Materials and methods 72
2.1.Materials 72
2.2.Preparation of MES and isolation of compounds 72
2.3.Animal study 73
2.4.Hepatotoxicity assessment 74
2.5.Measurement of lipid peroxidation 74
2.6.Determination of glutathione level 74
2.7.Western blotting 75
2.8.Separation of nuclear and cytosolic extract 75
2.9.Histopathological assessment 76
2.10.Statistical analysis 76
3.Results 77
3.1.Liver histopathology 77
3.2.Effect of MES on t-BHP-induced hepatic damage 77
3.3.Effect of MES on glutathione level in t-BHP-induced mice 80
3.4.Effect of MES on antioxidant enzyme activities 83
3.5.Effect of MES on GSH-related enzyme activities 83
3.6.Effect of MES on the activation of Nrf2 86
4.Discussion 88
5.Conclusions 91
ChapterⅤ.Sargahydroquinoic acid suppresses oxidative stress in tert-butyl hydroperoxide-induced HepG2 cells 92
1.Introduction 93
2.Materials and methods 96
2.1.Materials 96
2.2.Isolation of SHQA 97
2.3.Cell culture and viability assay 98
2.4.Determination of ROS production 98
2.5.Measurement of lipid peroxidation 99
2.6.Determination of glutathione level 99
2.7.Measurement of antioxidant enzyme activities 100
2.8.Western blotting 100
2.9.Separation of nuclear and cytosolic extract 101
2.10.Immunofluorescence microscopy 101
2.11.Statistical analysis 102
3.Results 103
3.1.Hepatoprotective effect of SHQA 103
3.2.Effect of SHQA on the inhibition of ROS production and lipid peroxidation 103
3.3.Effect of SHQA on glutathione levels 106
3.4.Effect of SHQA on catalase and SOD activities 106
3.5.Effect of SHQA on expression of HO-1, NQO1 and Nrf2 109
3.6.Effect of SHQA on phosphorylation of MAPKs 113
3.7.Effect of SHQA on activation of Akt/Fyn pathway 115
4.Discussion 117
5.Conclusions 120
References 122
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