In vitro tyrosinase inhibitory phlorotannins from Ecklonia stolonifera

Abstract

Tyrosinase 효소가 주로 관여하여 색소 침착을 촉진하는 멜라닌 합성을 증가시킴으로써 발생되는 과다색소침착은 피부 관련 질환들의 주요 원인이다. 이번 연구의 목적은 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려진 phlorotannins이 풍부한 곰피로부터 천연 tyrosinase 저해제를 찾는 것이다. 이번 연구에서, 곰피 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 단일 화합물 974-A, eckol, phlorofucofuroeckol-A, phloroglucinol을 분리 및 동정하였다. 분리한 화합물들 중에서, eckol, phlorofucofuroeckol-A 그리고 974-A가 mushroom tyrosinase에 대하여 저해 활성을 나타내었다. 특히, 975-A가 가장 뛰어난 저해 효과를 나타내었고 L-tyrosine과 L-3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)을 기질로 했을 때 각각 1.57 ± 0.08 그리고 3.56 ± 0.22 µM의 IC50 값을 가지는 것으로 나타났다. Kinetic 실험을 통해서 974-A가 경쟁적 저해제임을 Lineweaver-Burk plot을 통해 확인하였고, Dixon plot을 통하여 Ki 값이 L-tyrosine과 L-DOPA를 기질로 하였을 때 각각 0.69 그리고 0.33 µM인 것으로 확인되었다. 게다가, in silico 분자 도킹 시뮬레이션을 통하여 화합물의 하이드록실기와 페놀 고리가 tyrosinase 효소의 잔기들과 각각 많은 수소 결합과 소수성 상호작용을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 다음으로, B16F10 흑색종 세포를 이용하여 974-A의 색소 침착 저해 기전을 더 알아보았다. α-MSH 처리된 B16F10 흑색종 세포의 멜라닌 함량과 세포 tyrosinase 활성에 대한 eckol, phlorofucofuroeckol-A 그리고 974-A의 효과를 측정하였으며, 양성대조군으로 알부틴을 사용하였다. 실험 결과, 플로로탄닌들은 농도 의존적으로 α-MSH 처리된 B16F10 흑색종 세포의 멜라닌 함량을 감소시켰고 세포 tyrosinase 활성을 억제 시켰다. 또한, 멜라닌생성 관련 유전자인 tyrosinase, tyrosinase-related protein (TRP)-1 그리고 TRP-2의 발현을 플로로탄닌들이 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 더 나아가서, 이들 화합물의 뛰어난 라디컬 소거 능력을 peroxynitrite, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 그리고 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS•+) 실험을 통해서 확인하였고, 세포 내에서의 reactive oxygen species (ROS)의 소거 능력 또한 뛰어난 것으로 나타났다. 따라서 이번 연구 결과는 곰피에서 분리된 플로로탄닌들이 과다색소침착과 관련된 피부 질환을 치료 및 예방하는데 효과적인 약물로 사용될 가능성을 보여준다.