Microcarrier와 반연속배양 시스템을 이용한 고농도 megalocytivirus 백신의 효율적인 대량 생산
- Alternative Title
- Microcarrier based semibatch culturing system for efficient mass production of high dose megalocytivirus vaccine
- Abstract
- We achieved optimized cell growth on the surface of cytodex 1 (5 mg/mL) in spinner flask with stirring of 70 rpm after inoculation of 1x105 PMF cells/mL in L-15 medium with 5% FBS medium. Cultured PMF cells in every 3 days without subculturing, which can be called as a semi batch culturing system (SBCS). Cell density of PMF in SBCS (1.81x106cells/mL) was more than 1.5 times higher than that cultured in T-flask. Moreover, PMF of SBCS was sustainable even after inoculation of megalocytivirus by persistent infection for more than 20 media exchanges at intervals of 3 days to harvest the produced virus supernatant. In the characterization of viral productivity, despite the similar virus productivity in a single cell (specific virus productivity, SVP, approximately 1,000 virus particles/cell) in persistently infected PMF (PI-PMF) in spinner flask and T-flask, the increased total cell number due to large space in microcarrier allowed us to obtain efficiently a much higher peak concentration of virus (1010 viral particles/mL) than that produced in PI-PMF. In order to obtain more increased virus concentration in SBCS, 0.5% serum of black sea bream was added in culturing medium as additive. This resulted in enhanced cell growth (maximum concentration of cell, 1.16x107 cells/mL), as well as improved virus concentration (maximum titer, 6.72x1010 viral particles/mL) in the supernatant. The produced virus was inactivated with 0.1% formalin for 3 hours at 37℃ with sufficient safety, and two different doses of vaccine, high-dose supernatant of cultured megalocytivirus vaccine (HSCMV, 2.0x109 viral particles/mL), supernatant of cultured megalocytivirus vaccine (SCMV, 2x109 viral particles/mL) were prepared. Each group of rock bream (Oplegnathus fasciatus) immunized with HSCMV and SCMV for 2 weeks showed cumulative mortality of 21.8% and 46.5% respectively with increased expression of Mx gene and neutralization antibody titre. Although fish with HSCMV showed slightly increased immune responses compared to that found in SCMV group, further statistical analysis might be needed after more trials of experiments. Effectiveness of a HSCMV was evaluated in a field trial. After vaccination with HSCMV (10,500 and 12,500 vaccinated and control group, respectively) in ground tank, the fish were held for 1 week, then transferred to a marine net pen and observed for 100 days from 26th of July to 3rd of November. The cumulative mortalities caused by red sea bream iridoviral disease (RSIVD) in the vaccinated group or control group were 13.4 and 85.6%, respectively. In the vaccinated group, virus was not detected, but was detected in control group by PCR after 7 and 9 weeks of vaccination. Additionally, during the course of the disease, it was also confirmed that there was a sufficient concentration of viruses in the surrounding sea water and adherent organisms that could be detected by 1st PCR. The increase in body weight of vaccinated fish was also significantly (p<0.05) greater than that of control fish. These results suggest that the HSCMV against RSIVD was highly effective in field trial, which is enough to promise the protection of RSIVD in aquaculture industry of rock bream. In further expanded study, we confirmed the cross protection of HSCMV to prevent the occurrence of high mortality by the infection of subgroup II (PGIV) megalocytivirus in rock bream. Furthermore, high dose injection of live subgroup III (FLIV) megalocytivirus also have the potential to use as a live vaccine against RSIVD, which is different from that found with low dose that does not work. In conclusion, we developed a very efficient megalocytivirus production system based on microcarrier for high-dose vaccine to prevent the RSIVD in rock bream, and proved the efficacy both in laboratory and field.
- Issued Date
- 2019
- Awarded Date
- 2019. 8
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 수산생명의학과
- Advisor
- 정현도
- Table Of Contents
- 제 1장. Microcarrier에서의 어류 세포 배양 1
1. 서 론 1
2. 재료 및 방법 5
2.1. 주화 세포 5
2.2. Microcarrier의 준비 6
2.3. 세포 수 측정 8
2.4. 다양한 종류의 microcarrier 9
2.5. Microcarrier에서의 PMF 세포의 배양 10
2.5.1 세포 배양의 조건 확립 10
2.5.2. 계대 배양 12
2.5.3. 다양한 어류 주화 세포의 배양 13
2.5.4. Microcarrier의 재활용 14
3. 결과 15
3.1. 다양한 종류의 microcarrier에서의 세포 성장 15
3.1.1 세포 초기 부착률 비교 15
3.1.2 세포 성장 비교 21
3.2. Microcarrier의 세포 배양 조건 확립 24
3.2.1 Microcarrier 농도 24
3.2.2 교반 속도 24
3.2.3 첨가 세포 농도 25
3.2.4 배지 교환 주기 26
3.2.5 혈청의 종류 및 농도 27
3.3. Microcarrier와 T-flask에서의 PMF 세포의 배양 특성 31
3.4. PMF 세포의 계대 배양 35
3.5. 다양한 어류 주화 세포의 배양 37
3.6. Microcarrier의 재활용 39
4. 고찰 41
제 2장. Microcarrier에 배양된 어류 세포에서의 바이러스 생산 46
1. 서론 46
2. 재료 및 방법 49
2.1. 주화 세포 49
2.2. 바이러스 50
2.3. DNA의 분리 51
2.4. 바이러스의 정량 분석 52
2.5. 반연속배양(semi-batch culturing system)의 적정 조건 확립 53
2.6. Megalocytivirus의 반연속배양 특성 54
2.6.1. 단일 세포에서 생산되는 바이러스 54
2.6.2. 숙주 세포에서 나타나는 바이러스 생산의 변화 55
2.6.3. 반연속배양에서 생산된 바이러스의 감염성 56
2.7. Megalocytivirus의 다른 subgroup 바이러스 생산 57
2.8. 다양한 어류 바이러스의 생산 58
2.9. 어류 혈청 첨가물을 이용한 세포 배양 및 바이러스 생산 59
2.9.1. 최적의 세포 배양 조건 확립 59
2.9.2. 바이러스 생산 60
3. 결과 61
3.1. 반연속배양 시스템을 활용한 megalocytivirus의 생산 61
3.1.1. 다양한 microcarrier에서의 바이러스 생산 61
3.1.2. 배지 교환 주기에 따른 바이러스 생산 63
3.1.3. MOI가 바이러스 생산에 미치는 영향 65
3.1.4. 다양한 어류 주화세포에서의 반연속배양 67
3.2. Megalocytivirus의 반연속배양 특성 70
3.2.1. 세포수의 변화 70
3.2.2. 단일 세포에서 생산되는 바이러스 양 73
3.2.3. 숙주 세포에서 나타나는 바이러스 생산의 변화 분석 75
3.2.4. 연속 생산된 바이러스의 감염성 확인 80
3.3. Megalocytivirus의 다른 subgroup 바이러스의 생산 82
3.4. 다양한 어류바이러스의 생산 85
3.5. 어류 혈청 첨가물에 의한 강화된 바이러스 생산 효과 89
3.5.1. 다양한 동물 유래의 혈청 첨가물이 세포 성장에 미치는 영향 89
3.5.2. 어류 혈청 첨가물의 농도에 따른 세포의 성장성 분석 91
3.5.3. 최적화된 조건에서 세포 배양 및 바이러스의 생산 93
4. 고찰 98
제 3장. 고농도 이리도바이러스 백신 조제와 효과 분석 105
1. 서론 105
2. 재료 및 방법 108
2.1. 실험어 108
2.2. 백신의 제조 109
2.3. 백신 효과 분석 110
2.3.1. 백신 농도 110
2.3.2. 인위 감염 방법 111
2.3.3. 사육 수온 112
2.3.4. Adjuvant 혼합 113
2.3.5. 백신의 stability 114
2.3.6. 백신의 지속성 115
2.4. 면역 유전자 발현 분석 116
2.5. 중화 항체가 측정 118
2.6. Megalocytivirus의 예방을 위한 새로운 접근 119
2.6.1 HSCMV 백신의 교차 방어 효과 119
2.6.2 비병원성 바이러스의 생백신 효과 120
3. 결과 121
3.1. Megalocytivirus 의 불활화 121
3.1.1 안전성 분석 121
3.1.2 불활화 조건이 백신 효과에 미치는 영향 124
3.2. 백신의 효과 126
3.2.1. 백신 농도에 따른 효과 126
3.2.2. 인위 감염 방법에 따른 백신 효과 128
3.2.3. 사육 수온이 백신의 효과에 미치는 영향 130
3.2.4. Adjuvant 효과 분석 132
3.2.5. 백신의 stability 134
3.2.6. 백신 투여 후 지속적 효과 분석 136
3.3. 백신 투여된 돌돔에서의 면역학적 변화 분석 138
3.3.1 인위 감염 이후의 면역 유전자 발현 분석 138
3.3.2 중화 항체가 분석 141
3.4. Megalocytivirus의 예방을 위한 새로운 접근 143
3.4.1 HSCMV의 교차 방어에 의한 subgroup II virus의 감염예방 143
3.4.2 비병원성 바이러스의 생백신 효과 148
4. 고찰 154
제 4장. 현장에서의 백신 효과 분석 161
1. 서론 161
2. 재료 및 방법 168
2.1. 백신의 조제 169
2.2. 백신의 접종 169
2.3. 샘플링 171
2.4. 백신 효과 분석 173
2.5. 실험실에서의 현장 모의실험 174
2.6. 염기서열 및 계통수 분석 175
3. 결과 177
3.1. 현장에서의 백신 효과 분석 177
3.1.1 SCMV의 현장 효과 177
3.1.2 HSCMV의 현장 효과 179
3.2. 어체의 성장 183
3.3. 현장 시료의 감염 상태 변화 분석 185
3.4. 주변 환경에서의 바이러스 검출 189
3.5. 현장 어류를 사용한 실험실에서의 모의 실험 192
3.6. 중화 항체가 분석 197
3.7. 현장에서 발생한 megalocytivirus의 분자생물학적 분석 200
4. 고찰 210
요 약 218
감사의 글 221
참 고 문 헌 224
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