Promotive effect of spirulina proteins on skin wound healing

Abstract

피부는 표피와 진피로 구성되며, 인체의 외부환경에 대한 가장 큰 방어기관으로 작용한다. 따라서 피부의 상처는 내과 신체의 경계를 허물어 심한 육체적인 부담을 초래한다. 상처의 치유 과정에 관여하는 주요 복구세포로 섬유 아세포가 있으며, 피부 상처 치유를 위해 섬유 아세포에 관한 연구가 필요하다. 청녹색의 미세조류인spirulina는, 높은 단백질 함량 및 영양가로 이상적인 영양공급원으로 이용되어 왔으며, 현재 spirulina가 가지고 있는 영양소 성분이 여러 질병(항암, 노화 억제, 비특이적 세포 면역 기능 강화)을 효과적으로 치료하는 것으로 광범위하게 연구되고 있다. 최근연구에 의하면 Spirulina platensis의 추출물은 섬유 아세포의 증식을 촉진하고 상처치료를 촉진하는 것으로 밝혀졌지만 아직까지 상처치료 작용에 의한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 인간 피부 섬유 아세포인 CCD-986sk와 C57BL-6 마우스에 대한 spirulina 조단백질 (SPCP)의 효과와 해당 메커니즘을 규명하고자 하였다. 먼저 in vitro 분석을 위해 인간 피부 섬유 아세포 세포주인 CCD-986sk 세포가 인간 피부 세포에 대한 스피룰리나 조단백질 (SPCP)의 효과를 측정하기 위해 사용되었다. CCD-986sk 세포의 증식에 대한 SPCP의 효과를 확인하기 위한 Bromodeoxyuridine (BrdU) assay와 MTS assay 분석을 통해 SPCP가 CCD-986sk 세포의 증식을 촉진한다는 것을 확인하였다. 다음으로 피부상처 치유에 주요 역할을 하는 콜라겐과 elastase를 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)을 하였을 때, SPCP를 처리 한 세포에서 콜라겐 형성이 용량 의존적으로 개선되는 것을 보여 주었으며, elastase 활성은 감소했다. 또한 섬유 아세포의 새로운 조직 형성에 증식 및 이동과정을 동반하는것으로 밝혀졌다. 따라서 CCD-986sk 세포의 이동에 대한 SPCP의 효과를 wound-healing assay로 분석하였을 때, SPCP가 CCD-986sk 세포의 이동을 유의하게 유도하는 것을 확인하였다. 세포 증식은 세포주기와 성장인자 신호전달 경로사이의 상호작용에 의해 조절된다. 따라서, 세포주기 분석을 시행하였을 때, SPCP는 CCD-986sk 세포의 G0/G1 상으로부터 S 및 G2/M 상으로 진행하는 것을 촉진 하였다. 또한, 세포주기 관련 단백질의 발현 수준을 western blot 분석을 하였을 때, SPCP가 cyclin D1, cyclin E, Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) 및 Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)의 발현을 유의하게 증가시키고 CDK 억제제인 p21과 p27의 발현을 억제하는 것을 확인하였다 다음으로 주요 세포 성장 신호 전달 경로를 western blot 분석하였을 때, SPCP는 CCD-986sk 세포에서 상피 세포 성장 인자 수용체 (EGFR) 활성을 상향 조절하였으며, EGFR의 신호를 마이토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로로 전달하는GRB2, SHC 및 구아닌 뉴클레오타이드 교환 단백질 (SOS)를 포함한 EGFR의 어댑터 단백질의 발현의 증가 및 MAPK/세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK) 신호 전달 경로의 활성화를 확인하였다. 다음으로 SPCP는 또다른 세포성장 신호전달경로인 phosphoinositide 3-kinase (PI3K)와 serine-threonine kinase (Akt)의 인산화와 활성화를 촉진한다는 것을 확인하였다. PI3K/Akt 신호 전달 경로의 억제제인 PTEN을 분석하였을 때, PTEN의 발현 수준이 SPCP 처리에 의해 감소하였으며, 포유류 세포 증식 조절에 중요한 역할을하며 p-Akt에 의해 활성화되는 mTOR 의 인산화가 증가로 mTOR신호가 활성화되는 것을 확인하였다. mTOR 신호에 대한 중요한 인산화 기질인 4EBP1 및 p70S6K 의 인산화 SPCP에 의해 촉진되었으며, 핵에서 elF4E의 발현증가로 SPCP에 의해 활성화된 4EBP1이 elF4E를 방출하여 단백질 합성을 촉진하는 것을 확인하였다. 많은 전사 인자의 활성은 β-catenin의 영향을 받으며, GSK3β에 의해 분해 될 수 있다. Western blot 분석은 GSK3β의 활성이 p-Akt에 의해 억제되었으며, β-catenin이 방출되었다. CCD-986sk 세포에서 SPCP에 의한 증식 및 이동에서 ERK 및 Akt 신호전달경로의 역할을 추가로 확인하기 위해 ERK 억제제 (U0126) 및 PI3K 억제제 (LY294002)를 사용하였다. 그 결과, CCD-986sk 세포에서의 SPCP 유도 된 증식 및 이동은 U0126 및 LY294002에 의해 차단되었으며, 이러한 결과로 SPCP에 의해 유도 된 증식 및 이동이 ERK 및 Akt 신호 전달 경로에 의해 조절된다는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구 결과는 SPCP가 인간 섬유 아세포 CCD-986sk 세포의 증식과 이동을 촉진시키고, 이 과정에서 EGFR/MAPK 및 PI3K/Akt 신호 전달 경로가 주요 역할을하는 것을 의미한다. In vitro 실험에서의 결과를 토대로 in vivo 모델에 적용하여 그 효과를 밝히기 위해 피부상처를 가진 mouse 모델을 사용하여 SPCP의 상처치유촉진효과를 검증하였다. 특히, SPCP는 피부 상처를 가진 마우스 모델에서 상처 치유를 촉진하였으며, SPCP의 처리는 바세린을 처리하였을 때보다 상처봉합율이 높은 것을 확인하였다. 또한 산화 스트레스는 상처 치유를 지연시키는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 상처 치유에 대한 SPCP의 항산화 효과를 분석하였다. ELISA의 결과는 SPCP가 superoxide dismutase (SOD)와 catalase (CAT)의 활성을 증가 시킨다는 것을 의미하였으며, 지질 과산화 (MDA)의 수준은 SPCP의 처리에 의해 감소되었다. 이러한 결과는 SPCP가 C57BL/6 마우스의 피부 상처 치유에 항산화 효과가 있음을 나타낸다. 또한, SPCP는 C57BL / 6 마우스의 피부 창상 조직에서 α 평활근 액틴 (α-SMA)의 발현을 촉진시켰으며, 이 결과는 SPCP가 근섬유 아세포의 분화를 촉진한다는 것을 시사한다. 한편, western blot 결과는 마우스 피부 창상 조직에서 SPCP에 의해 ERK와 Akt의 인산화가 유의하게 향상되었으며, SPCP가 ERK 및 Akt 신호 전달 경로에 의해 세포 증식을 촉진한다는 것을 의미한다. 다음으로 변형 성장 인자 -β1 (TGF-β1)/Smad2 신호 전달 경로가 SPCP에 의해 활성화되었으며, 콜라겐 I 형 알파 1 (COL1A1)과 콜라겐 I 형 알파 2 (COL1A2)의 발현 또한 촉진시켰다. 이 결과는 SPCP가 상처 치료에서 콜라겐의 축적을 유도 함을 나타냅니다. 종합하면, SPCP가 항산화제에 의해 피부 상처 치유를 촉진시키고 피부 섬유 아세포의 증식과 이동을 증가시키고 콜라겐 합성을 촉진하여 근섬유 아세포 수준을 증가시킴을 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 SPCP가 피부 창상 치유를 촉진하는 분자 메커니즘을 밝혀주고 피부 상처 치료를위한 잠재적인 치료제로서 활용될 수 있음을 시사한다.