Chlorella vulgaris 염 유도성 프로모터 분리 및 미세조류 형질전환 벡터 제작

Abstract

클로렐라는 단백질의 함량이 높은 단세포 조류이다. 이 조류는 번역 후 변형이 가능하여 백신과 백신 보조제, 호르몬과 같은 기능성 단백질을 합성이 가능하다. C. vulgaris에서 외래 유전자 단백질 발현 효율을 증가시키기 위해 C. vulgaris에서 salt induced promoter (SIP)를 분리하고 C. vulgaris transformation vector의 promoter로 이용함으로써 발현율을 높일 수 있다. C. vulgaris PKVL7422에 transformation하였고 2주간 암 배양한 뒤 DNA extraction과 PCR을 이용하여 유전자 내 SIP와 VHSV G gene의 삽입을 확인하였다. PCR결과 예상되는 위치에 681 bp, 873bp위치에 밴드를 확인할 수 있었다. 이는 homologous recombination으로 삽입되었다. Western blotting의 결과 밴드가 예상 사이즈 위치인70kDa, 56kDa에 확인하였다. 이는 삽입된 유전자가 세포 내에 스트레스에 반응하는 호르몬인 ABA, Gibberellin 증가하여, SIP promoter에 존재하는 ABRE site, P-box에 결합하여 downstream에 위치한 VHSV G gene의 발현을 유도한 것으로 추측된다. C. vulgaris PKVL7422 transformant를 2.3% NaCl 존재하는 BGPK broth에 30분 배양했을 때 VHSV G gene의 발현율이 가장 높았다. salt stress가 증가할수록 salt tolerance에 의해 막 구조의 변형을 야기해 이온 흡수를 제어한다. 본 연구에서는 저렴한 NaCl의 사용과 짧은 시간의 배양으로도 효율적으로 단백질의 축적을 유도할 수 있음을 시사한다.

Chlorella is a single cell alga with high protein content. The algae can be post-translationally modified to synthesize functional proteins such as vaccines, vaccine adjuvants and hormones. In order to increase the expression efficiency of foreign genes in C. vulgaris, it is possible to increase the expression rate by separating salt induced promoter (SIP) from C. vulgaris and using it as a promoter of C. vulgaris transformation vector. C. vulgaris was transformed into PKVL7422 and cultured for 2 weeks, followed by DNA extraction and PCR to confirm the insertion of SIP and VHSV G genes. As a result of PCR, a band was identified at the 681 bp and 873 bp positions. It was inserted into homologous recombination. As a result of Western blotting, the bands were identified at 70kDa and 56kDa. This suggests that the inserted gene increases ABA, Gibberellin, a hormone that responds to stress in the cell, and induces the expression of the VHSV G gene located downstream by binding to the ABRE site and P-box present in the SIP promoter. The expression of VHSV G gene was highest when C. vulgaris PKVL7422 transformant was incubated for 30 minutes in BGPK broth with 2.3% NaCl. As the salt stress increases, the salt tolerance causes the membrane structure to deform and control ion absorption. This study suggests that low-cost NaCl and short-term incubation can efficiently induce protein accumulation.