Cross-talk between inflammatory responses and ER stress by Gnaphalium affine extracts on macrophage cells

Abstract

염증은 병원체, 자극, 독성 화합물에 의한 중요한 반응이며 이 같은 유해 자극에 의해 유발되어 만성 염증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 패혈증, 알츠하이머 병과 같은 여러 질병을 유발한다. 대식세포는 지질 다당류 (LPS) 또는 사이토카인에 의해 유도되어 유도성 산화 질소 합성 효소 (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX) -2, prostaglandin E2 (PGE2)를 발현시킨다. 이러한 인자는 핵인자 κB (NF-κB), 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 및 핵인자 적혈구 2 관련 인자 2 (Nrf2)에 의해 조절된다. Phosphoinositide 3-키나제 (PI3K)는 단백질 세린/트레오닌 키나제 (PKB/Akt) 및 phosphoinositide-의존성 키나제 1 (PDK1)을 유발하고, 이들 단백질은 NF-κB 전사와 관련이 있다. 소포체 (ER) 스트레스는 단백질 폴딩 및 합성과 관련이 있으며, 잘못 접히거나 펼쳐진 단백질이 축적되면 염증이 시작된다. 떡쑥은 라틴 아메리카와 중국, 한국 등에서 요통, 말라리아 예방, 신경염 및 상처를 치료하는 데 사용되어 왔다. 하지만 세포 내 어떤 기전을 통해 치료가 되는지 분자학적 메커니즘이 아직까지 밝혀지지 않았다. 따라서 이 연구의 목적은 LPS로 자극 된 RAW264.7 대식세포에 대한 떡쑥 추출물의 항염증 메커니즘을 조사하는 것이다. 먼저 떡쑥 메탄올 추출물을 대식세포에 처리하여 NO 생성 및 PGE2 생성을 확인하였고, 떡쑥을 처리하면 농도가 증가할수록 NO와 PGE2의 생성을 감소시키는 효과가 있었다. 따라서 떡쑥을 다양한 용매로 분획하여 효과를 확인하였고, 분획물 중에서 떡쑥 클로로포름 분획물이 NO 생성을 억제하는 데 가장 효과적이어서 이후 실험에서 떡쑥 클로로포름 분획물을 사용하여 항염증 효과를 연구하였다. 떡쑥 클로로포름 분획물은 NF-κB 인산화를 통해 iNOS 및 COX-2 발현을 감소 시키는데 영향을 주었고, 이는 떡쑥 메탄올 추출물의 항염증 효과만큼의 효능을 보였다. 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 전 염증성 사이토카인의 단백질 및 mRNA 수준을 모두 억제하는 데 영향을 미쳤다. 또한, 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 MAPK 발현뿐만 아니라 세포 외 조절 단백질 키나아제 (ERK) 발현과 관련된 상위 단백질 및 하위 단백질의 발현을 억제하는데 효과를 보였다. 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 자극된 대식세포에서 HO-1과 Nrf2 발현을 농도 및 시간 의존적으로 증가시켰다. 이는 떡쑥 메탄올 분획물과는 다른 양상을 보였으므로, 분획되면서 물질의 변화가 있었을 것으로 추측한다. 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 유도된 대식세포에서 PI3K, PDK-1, Akt의 인산화를 억제하고 PTEN 발현을 증가시키는데 효과를 보였다. 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 ER 스트레스 경로를 억제하고 ER을 통해 형성되는 칼슘 발현을 감소시키는데 영향을 주었다. 또한 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 유도된 대식세포에서 ER 스트레스 관련 단백질의 상위 인자인 IκB 키나제 (IKK) 인산화를 억제하고, 활성화 제 단백질 (AP) -1을 억제하였다. PI3K와 ER 스트레스 관계를 연구하기 위해, LPS로 자극된 대식세포에서 PI3K 억제제를 처리하여 단백질 변화를 관찰하였다. 떡쑥 분획물은 PI3K 신호 전달 경로를 통한 이노시톨-필요 단백질 1 (IRE1) 및 활성화 전사 인자 6 (ATF6) 발현을 억제하는 효과를 보였으며 특히 세포 내의 ATF6의 발현도 억제하는 것으로 보였다. 종합하여 보면, 떡쑥 추출물은 LPS로 유도된 대식세포에서 iNOS, COX-2, 전 염증성 사이토카인과 같은 염증 매개체의 발현을 NF-κB, MAPK, Nrf2, PI3K/Akt 및 ER 스트레스 기전에 의해 감소시키는데 효과를 보였다. 또한, 떡쑥 클로로포름 분획물은 LPS로 자극 된 RAW264.7 세포에서 PI3K/Akt를 통해 ER 스트레스 단백질 발현을 조절 하였다. 이를 통해 떡쑥 클로로포름 분획물이 PI3K/Akt 및 ER 스트레스 경로의 단백질 발현을 조절함으로써 염증 관련 단백질을 억제하는 데 영향을 주었다고 볼 수 있다. 이 결과는 떡쑥이 약리학적 치료에 사용되기 위한 기초 정보를 시사한다고 볼 수 있다. 떡쑥 클로로포름 분획물에는 19개의 다른 화합물이 존재하였으며 그 중에 30%만이 생리학적 효과가 보고되어 나머지 화합물의 연구가 필요하다고 생각한다.

Inflammation is important responses of pathogens, stimuli, toxic compounds and triggered by harmful irritation, which causes chronic inflammation and several diseases, such as rheumatoid arthritis, diabetes, sepsis, and Alzheimer’s diseases. Macrophages are induced by lipopolysaccharide (LPS) or cytokines, which cause to express inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2, prostaglandin E2 (PGE2). Those factors are regulated by nuclear factor κB (NF-κB), mitogen activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) triggers protein serine/threonine kinase (PKB/Akt) and phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), and those proteins regulate the downstream of nuclear factor-κB (NF-κB) transcription. Endoplasmic reticulum (ER) stress is related in protein folding and synthesis. When unfolded or misfolded proteins are accumulated, it causes to initiate the inflammation. Gnaphalium affine is used to treat low back pain, antimalarial, neuritis, and wounds in Latin American countries and China; however, the plasma level was not studied yet. The purpose of this research is to examine the anti-inflammatory mechanism of G. affine extract on LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells. First tested G. affine methanol extract and it had an effect to decrease the NO production and PGE2 production. Next checked the G. affine fractions effect, and among the fractions, G. affine chloroform (CHCl3) had the most effective to inhibit NO production. Further studies, used G. affine CHCl3 fraction to study anti-inflammatory effect on LPS-stimulated RAW264.7 cells. G. affine CHCl3 also influences to decrease the iNOS and COX-2 expression via NF-κB phosphorylation as much as G. affine methanol extract. G. affine CHCl3 affect to inhibit both the protein and mRNA levels of pro-inflammatory cytokines on LPS-stimulated RAW264.7 cells. Moreover, G. affine CHCl3 fraction had an effect to suppress the MAPKs expression as well as up- and down-stream of extracellular regulated protein kinase (ERK) expression on LPS-induced RAW264.7 cells. Another effect of G. affine CHCl3 is to increase the HO-1 and Nrf2 expression on LPS-stimulated RAW264.7 cells followed by concentration as well as time dependent. Also, G. affine CHCl3 fraction had an effect to inhibit the phosphorylation of PI3Ks, PDK1 and Akt phosphorylation, and increase the PTEN expression on LPS-induced RAW264.7 cells. In addition, G. affine CHCl3 fraction influences to suppress the ER stress pathway and decrease the Ca2+ expression on LPS-stimulated RAW264.7 cells. In addition, G. affine CHCl3 fraction inhibited IκB kinase (IKK) phosphorylation by upstream of ER stress related proteins, also suppressed the activator protein (AP)-1 on LPS-stimulated RAW264.7 cells. Next, to study PI3K and ER stress relation, treated PI3K inhibitor on LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells. G. affine CHCl3 fraction had an effect to inhibit the inositol-requiring protein1 (IRE1) and activating transcription factor6 (ATF6) expression via PI3K signaling pathway. Taken together, G. affine extract had an effect to decrease the expression of inflammatory mediators, such as iNOS, COX-2, pro-inflammatory cytokines and those factors are mediated by NF-κB, MAPK, Nrf2, PI3K/Akt, and ER stress pathway on LPS-stimulated RAW264.7 cells. Moreover, G. affine CHCl3 fraction regulated the mediation of ER stress proteins through PI3K/Akt on LPS-stimulated RAW264.7 cells. It suggests G. affine CHCl3 fraction affect to inhibit the inflammatory related proteins by resisting PI3K/Akt and ER stress pathway, and those results suggest the basal information of G. affine for using pharmacological treatment. The components of G. affine CHCl3 fraction was analyzed by GC/MS and there exists nineteen different constituents. Among the constituents, only 30% of compounds were studied the biological effects; therefore, for further studies, it may need to research their biological effects of compounds derived from G. affine CHCl3 fraction.