Dopamine receptor regulatory mechanisms of phlorotannins and fucoxanthin

Abstract

효과적인 중추신경계 질환의 치료를 위하여 단일 화합물을 통한 여러 단백질 타겟들의 조절이 새로운 전략으로 많이 연구되고 있다. 모노아민 산화 효소와 생체 호르몬들과 신경전달물질들의 세포내 반응을 매개하는 G-단백질 연결 수용체는 다양한 뇌 질환들의 주요 타겟으로 여겨지고 있다. 중추신경계 약물로써 기능을 할 수 있는 해조류 유래 이차대사산물을 찾기 위한 과정에서, 우리는 이전의 연구에서 엑콜, 디엑콜 그리고 푸코잔틴의 In vitro 모노아민 산화 효소-A 저해 활성을 확인하였다. 흥미롭게도, 모노아민 산화 효소 저해제가 도파민 수용체를 간접적으로 조절할 수 있다는 연구 결과가 이전에 보고되었다. 따라서, 우리는 엑콜과 디엑콜 구조의 기본 골격인 플로로글루시놀을 포함하는 여러 플로로탄닌들의 모노아민 산화 효소 저해 효과를 스크리닝한 후, 모노아민 산화 효소 저해 활성을 나타내는 해조류 유래 화합물들의 도파민 수용체를 비롯한 여러 G-단백질 연결 수용체의 조절 효과를 확인하고 분자 도킹 시뮬레이션을 통하여 작용 메커니즘을 확인하고자 하였다. 이번 연구에서, 미역과 대황으로부터 각각 갈조류의 대표적인 색소와 스테롤인 푸코잔틴과 푸코스테롤을 분리했고, 곰피로부터 5개의 플로로탄닌을 분리했다. 모노아민 산화 효소 억제 실험 결과, 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 모노아민 산화 효소의 두 이성질체 모두에 뛰어난 저해 효과를 보였으며, 특히 모노아민 산화 효소-B 효소에 더 선택적인 저해를 하는 것으로 확인되었다. 하지만, 플로로글루시놀, 디옥시노데하이드로엑콜 그리고 푸코스테롤은 두 이성질체 모두에 효과를 보이지 않았다. 가장 뛰어난 효과를 보인 플로로퓨코퓨로엑콜-A의 모노아민 산화 효소 저해 양상을 확인하기 위하여 효소 키네틱 연구를 실시하였다. 그 결과 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 두 이성질체에 모두 비경쟁적 저해제로 작용한다는 것을 Lineweaver-Burk plot과 이의 secondary plot을 통하여 확인하였고, 모노아민 산화 효소-A보다 모노아민 산화 효소-B에 대한 플로로퓨코퓨로엑콜-A의 저해상수가 더 낮은 것으로 나타났다. 또한, 분자 도킹 모의실험 결과에서 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 모노아민 산화 효소의 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드-결합 위치를 포함하는 촉매 부위가 아닌 다른 부위에 음의 결합 에너지로 강하게 결합하였으며, 이는 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 비경쟁적 저해제임을 보여준다. 다음으로 세포-기반 기능성 검정 실험을 통하여 해조류에서 분리된 모노아민 산화 효소 저해 활성을 지니는 화합물들의 뇌 질환에 관여하는 다양한 G-단백질 연결 수용체들에 대한 효현제/길항제 효과를 확인하였다. 고리형 아데노신 일인산 측정 실험을 통해서 엑콜, 디엑콜, 플로로퓨코퓨로엑콜-A 그리고 푸코잔틴이 도파민 D2-like 수용체에 속해있는 도파민 D3와 D4 수용체의 효현제로 작용하는 것이 확인되었다. 이외에도 100 μM 농도의 디엑콜과 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 도파민 D1 수용체, 뉴로키닌 1 수용체 그리고 세로토닌 1A 수용체의 길항제로 작용하여 효현제로 유도된 G-단백질 연결 수용체 신호 전달 반응을 억제시키는 것을 확인했다. 이러한 실험적 결과를 뒷받침하기 위해서, 해조류 유래 활성 화합물들의 도파민 수용체들에 대한 분자 수준의 작용 메커니즘을 컴퓨터 모의 실험을 통하여 예측하였다. 엑콜, 디엑콜, 플로로퓨코퓨로엑콜-A 그리고 푸코잔틴은 도파민 D3와 D4 수용체의 세번째 막 관통에 위치하는 아스파라진 잔기와 강한 수소결합 또는 정전기적 결합을 형성하였으며, 이러한 결합은 이들의 도파민 D3 수용체 조절 효과를 설명할 수 있다. 또한, 페닐알라닌-346 잔기가 엑콜의 도파민 D3 수용체에 대한 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 분자 동력학적 모의 실험을 통하여 확인했다. 모노아민 산화 효소와 G-단백질 연결 수용체 뿐만 아니라 아밀로이드-베타 응집과 단백질 당화로 인한 최종당화생성물의 형성 그리고 뇌 지질 과산화에 의한 신경 손상 등도 신경 질환의 발병에 주요한 역할을 하기 때문에 플로로탄닌의 아밀로이드-베타(25-35) 자가 응집, 인슐린 당화에 대한 저해 효과와 쥐 전뇌 균질액을 이용하여 지질과산화 억제 효과를 측정하였다. 디옥시노데하이드로엑콜, 디엑콜 그리고 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 10 μM의 농도에서 아밀로이드-베타(25-35)의 자가 응집을 효과적으로 억제한다는 것을 Thioflavin-T 실험을 통해 확인했고 이들이 아밀로이드-베타(25-35)의 베타-병풍구조의 형성에 주요 역할을 하는 잔기들과의 상호작용을 통하여 자가 응집을 방해하는 것을 분자 도킹 그리고 동력학적 모의 실험을 통하여 확인했다. 또한, 플로로퓨코퓨로엑콜-A는 D-리보스와 D-포도당으로 유도된 인슐린 당화를 농도-의존적으로 억제할 수 있음을 실험적으로 확인했고, 플로로퓨코퓨로엑콜-A가 인슐린의 포도당 결합 부위로 알려진 페닐알라닌-1 잔기와 강하게 결합하는 것을 컴퓨터 모의 실험을 통하여 확인했다. 마지막으로, 뇌-균질액을 이용한 지질과산화 실험을 통하여 플로로글루시놀을 제외한 다른 플로로탄닌들이 모두 농도-의존적인 지질과산화 억제 효과가 있음을 확인했다. 결론적으로, 모노아민 산화 효소 저해 활성을 지니는 해양 갈조류 유래 푸코잔틴과 플로로탄닌이 도파민 D3와 D4 수용체의 효현제로 작용함으로써 파킨슨 질환과 우울증을 포함하는 신경 질환의 치료에 도움이 될 것으로 생각된다. 또한, 플로로탄닌은 모노아민 산화 효소 억제와 G-단백질 연결 수용체 조절뿐만 아니라, 아밀로이드-베타(25-35) 자가 응집, 인슐린 당화 및 지질과산화의 억제를 통해 뇌신경 손상을 예방하는데 도움이 될 것이다.

Modulation of multiple protein targets with a single compound is essential for the effective treatment of central nervous system disorders. Monoamine oxidase (MAO) and the G protein-coupled receptor (GPCR), which mediate cellular responses to various hormones and neurotransmitters, serve as prime targets for CNS drug discovery. In the previous study, eckol, dieckol, and fucoxanthin showed selective human MAO (hMAO)-A inhibition. In addition, there are studies that have discovered that specific MAO inhibitors could control dopamine receptor indirectly. Therefore, in the present study, in vitro modulatory effects of marine derived compounds on hMAO-A and B and various neuronal GPCRs including dopamine receptors were evaluated. In addition, in silico computational predictions were conducted to obtain molecular insights into the functional effects of marine derived compounds. First of all, representative pigment and sterol of edible brown alga, fucoxanthin and fucosterol, were isolated from Undaria pinnatifida and Eisenia bicyclis, respectively, and five phlorotannins were isolated from Ecklonia stolonifera. The hMAO inhibition assay results revealed that phlorofucofuroeckol-A (PFFA) showed the strongest inhibitory activity against both hMAO isoforms with higher selectivity toward hMAO-B than hMAO-A among the tested compounds. Enzyme kinetics and docking data revealed that PFFA noncompetitively acts on hMAOs into the alternative binding pocket of enzymes with allosteric functions. However, phloroglucinol, dioxinodehydroeckol, and fucosterol did not show any inhibitory effect on both hMAO isoforms. Cell-based functional assay was conducted to screen the agonist/antagonist effects of isolated compounds on neuronal GPCRs including human dopamine D1, D3, and D4 (hD1R, hD3R, and hD4R), neurokinin 1 (hNK1R), serotonin 1A (h5HT1AR), and vasopressin 1A (hV1AR) receptors. As a result, eckol, dieckol, PFFA, and fucoxanthin act as agonist of hD3R and hD4R, which are belong to dopamine D2-like receptor. In addition to the dopamine receptor, 100 µM of dieckol and PFFA exhibited antagonist effect on hD1R, hNK1R, and h5HT1AR. In silico computational analysis confirmed that eckol, dieckol, PFFA, and fucoxanthin successfully interacted with conserved active sites of hD3R and hD4R and interacted with aspartyl (Asp110-hD3R and Asp115-hD4R) and serine residues in the orthosteric binding pockets of the respective receptors via H-bond or electrostatic interactions. In addition, molecular dynamics simulation revealed that Phe346 of the hD3R is important for binding of eckol, similar to eticlopride and dopamine. Various factors can influence neuronal disorder apart from MAO and GPCRs, including misfolded or aggregated amyloid-β (Aβ) peptides, glycated protein, and lipid peroxidation. Therefore, anti-Aβ25-35 aggregation, anti-insulin glycation, and anti-lipid peroxidation activities of phlorotannins were evaluated. Thioflavin-T assay results suggest that eckol, dioxinodehydroeckol, dieckol, and PFFA significantly inhibit Aβ25-35 self-assembly. Molecular docking and dynamic simulation analyses confirmed that these phlorotannins have a strong potential to interact with Aβ25-35 peptides and interrupt their self-assembly and conformational transformation, thereby inhibiting Aβ25-35 aggregation. In addition, PFFA dose-dependently inhibited D-ribose and D-glucose induced non-enzymatic insulin glycation. To understand the molecular mechanism for insulin glycation and its inhibition, binding site of PFFA in insulin was predicted via computational analysis. Interestingly, PFFA strongly interacted with the Phe1 in insulin chain-B, and this interaction could block D-glucose access to the glycation site of insulin. Furthermore, tested phlorotannins except for phlorogucinol effectively prevented ferrous ion induced lipid peroxidation in rat brain homogenates. Based on the experimental and computational data, the present findings suggest that phlorotannins and fucoxanthin derived from edible brown algae are potential agents for treatment of neuronal disorders including Parkinson’s disease and depression via inhibition of hMAO and stimulation of hD3R and hD4R. In addition, PFFA could be a new scaffold for treatment of neuronal disorders by inhibiting the formation of β-sheet rich structures in Aβ25-35 and advanced glycation end-products (AGEs) in insulin and preventing the lipid peroxidation in the brain.