Investigation of the HSP70 promoter of Chlorella vulgaris PKVL7422 for increasing the expression level of recombination protein

Abstract

Recently advances in recombinant proteins have been based on the development of expression systems for a variety of living organisms. Conventional expression systems include bacteria, mammalian cell, plant, and yeast. Microalgae are attracting attention as a new platform because they have several advantages such as easy required culture condition, rapid growth, high protein content, high capacity of lipid accumulation, low-cost. But, at the same time it has its limitations, low content of heterologous protein expression level. This is due to several factors, including promoters, enhancers or enhancer-like regulatory elements, codon usage bias, proteolytic degradation, and gene silencing. In this study, we focused on inducible promoter among these factors. The heterologous protein was expressed by using an inducible promoter that can express a large amount of protein in a short time instead of the existing normally promoter that makes the heterologous protein of 1 ~ 2% among total proteins. the heterologous protein. HSP70 promoter as inducible promoter was identified by RNA-Seq of transcript generated by the wild type of host, Chlorella vulgaris PKVL7422. HSP70 promoter was analyzed for expression level of transcript under heat stress condition to confirm its potential as an inducible promoter. In addition, induction tests at various temperatures were performed to find the optimal induction conditions. The transformed microalgae confirmed the integration of the insert gene by PCR. The transformed microalgae were induced by the determined heat induction conditions and the expression level was confirmed by SDS-PAGE and western blot.

최근 재조합 단백질은 다양한 생물에서의 발현 시스템의 개발을 이루고 있다. 이전의 발현 시스템은 세균, 포유동물세포, 식물, 효모 등을 포함한다. 이중 미세조류는 쉬운 배양 조건, 빠른 성장속도, 높은 단백질 함량, 높은 지질 축적 능력, 저렴한 생산비용 등 여러가지 장점을 가지고 있어 새로운 플랫폼으로 주목받고 있다. 그러나 동시에 이종 단백질의 발현 수준이 낮다는 단점을 가진다. 이러한 단점은 프로모터, 인핸서 또는 인핸서와 유사한 조절 요소, 코돈 편중, 단백질 분해 및 유전자 침묵을 비롯한 여러 가지 요인 때문이다. 이 연구에서 우리는 이러한 요인들 중에서 유도성 프로모터에 중점을 두었고, 총 단백질의 1 ~ 2%의 이종 단백질을 만드는 기존의 프로모터 대신 단기간에 다량의 단백질을 발현 할 수 있는 유도성 프로모터를 사용하여 이종 단백질이 발현되었다. 유도성 프로모터로서의 HSP70 프로모터는 야생형의 숙주에서 NaCl 스트레스 처리된 전사체의 RNA-Seq에 의해 확인되었다. HSP70 프로모터를 열 스트레스 조건 하에서 전사체의 발현 수준을 분석하여 유도성 프로모터로서의 잠재력을 확인하였다. 또한 최적의 유도 조건을 찾기 위해 다양한 온도에서의 유도 시험이 수행되었다. 형질 전환된 미세조류는 중합효소 연쇄 반응에 의한 삽입 유전자의 통합을 확인하였다. 결정된 열 유도 조건에 의해 형질 전환된 미세 조류의 발현이 유도되었고, 발현 수준은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.