Versatile novel antimicrobial peptides derived from purification process of Mytilus coruscus and genome analysis strategy of Oplegnathus fasciatus

Abstract

본 연구는 항생제 남용의 문제점 및 사용제한에 따른 천연물 유래 항생제 대체재 개발을 위하여 우리나라와 중국, 일본에서만 서식하는 고유종인 참담치 (Mytilus coruscus)의 각 조직으로부터 항균 펩타이드를 분리 및 정제하였고 N-말단 서열을 확보 후 서열정보를 바탕으로 전체 아미노산 및 염기서열 분석, 펩타이드의 합성 및 재조합 단백질 제작을 통해 활성기반의 항균 펩타이드의 특성 분석에 대한 연구이다. 그리고 유전체 분석을 통해 돌돔 LBP (Lipopolysaccharide binding protein) 과 CDP (Catalytic domain of phopholipase)의 아미노산 서열을 기반으로 안전성과 항균활성이 증가된 유도체를 개발하여 다기능성 분석에 대한 연구이다. 첫 번째 연구에서 참담치의 족부 근육 추출물로부터 항균 펩타이드 mytichitin-CBD를 분리하였으며 이는 55개의 아미노산으로 구성된 6.2 kDa 의 펩타이드로 그람 양성, 음성, 진균류에서 강한 항균활성을 보였다. 그리고 조직별 시간별 정량 분석을 통해 mRNA가 족부근육에서 4시간째에 주로 발현이 되는 것을 확인하였다. 또한 재조합 단백질 제작으로 항균활성 뿐만 아니라 항기생충 활성도 확인하였다. 두 번째 연구에서 참담치의 족부 근육 추출물에서 분자량 6.7 kDa 의 항균 펩타이드 protamine-like protein을 분리 및 정제하였다. N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 20개의 아미노산 서열을 밝혔으며 이는 캘리포니아 홍합 (Mytilus californianus)의 sperm-specific protein 또는 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 상동성을 지님을 밝혀냈다. 이러한 정보를 바탕으로 open-reading frame (ORF)를 분석한 결과 60개의 아미노산을 코딩하는 183 bp로 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 아미노산 서열이 100% 일치하였고 유전자 염기서열은 97.2%의 상동성을 나타냈다. 합성된 항균 펩타이드는 그람 양성 균주 Bacillus cereus (MEC, 20.8 μg/mL), Bacillus subtilis (MEC, 0.2 μg/mL), Streptococcus mutans (MEC, 0.2 μg/mL), 그람 음성 균주 Pseudomonas aeruginosa (MEC, 5.7 μg/mL), Escherichia coli (MEC, 2.6 μg/mL) 그리고 진균류 Candida albicans (MEC, 56.3 μg/mL)의 항균활성을 나타냈다. 또한 높은 열안정성을 지녔으며, C. albicans를 제외하고 염안정성을 지닌 항균 펩타이드로 확인되었다. 세 번째 연구에서 참담치 hemocyte에 존재하는 항균 펩타이드를 분리 및 정제하였으며 이는 3.3 kDa이며, Edman 분해법을 통해 14개의 N-말단 아미노산 서열을 확보하였다. 분석한 N-말단 서열은 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1과 protamine-like PL-III protein과 각각 93%와 87%의 유사도를 나타냈으며, M. edulis의 sperm-specific protein Phi-1과 87% 일치함을 확인하였다. 또한 ORF는 306 bp의 길이에 101개의 아미노산을 코딩하고 있음을 밝혔으며, 이는 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1와 93.5% 유사하였다. 분자량과 아미노산 서열에 근거하여 31개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하였으며 이는 그람 양성균인 B. subtilis, S. mutans, S. aureus와 그람 음성균인 E. coli, Klebsiella. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa 그리고 진균류인 C. albicans에 항균 활성을 보였다. 합성한 펩타이드는 항생제 내성균주인 S. aureus CCARM 0203와 S. aureus CCARM 0204에 항균 활성을 보였다. 합성 항균 펩타이드는 넙치 혈장에 대한 용혈현상은 없었고, 세포독성을 확인한 결과 HUVEC cell line에 전혀 독성을 보이지 않았다. 본 연구 결과, 참담치의 혈구로부터 분리 및 정제한 sperm-specific protein 유래 항균 펩타이드는 다양한 균주에 항균 활성을 보였고 낮은 세포독성을 가졌으며, 이러한 특성은 본 실험에서 분리한 항균 펩타이드가 항생제 대체재로서 개발 가능성을 제시하고 있다. 네 번째 연구에서 참담치의 혈구 유래의 4 kDa 의 항균 펩타이드, mytilin을 분리 및 정제하였다. 25개의 N-말단 서열을 확보로 이는 참담치의 mytilin B precursor와 100%, mytilin 8 precursor, mytilin 4 precursor와 96% 일치하였다. 또한 103개의 아미노산 서열을 코딩하고 있는 312 bp의 ORF을 밝혔으며 이는 참담치의 mytilin B precursor와 100% 일치하였다. 밝혀진 분자량과 아미노산 서열을 바탕으로 C-말단 alanine 잔기의 유무에 따라 2개의 펩타이드를 합성하였으며 이는 mytilin B1과 B2라고 명명하였다. 이들은 그람 양성 균주 B. cereus, Streptococcus parauberis [minimal effective concentrations, MEC 41.6 - 89.7 μg/mL], 그람 음성 균주 Enterobacter cloacae, E. coli, K. pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia stuartii, P. aeruginosa, Vibrio ichthyoenteri [MEC 7.4 - 39.5 μg/mL] 그리고 진균류인 Candida albicans [MEC 26.0 - 31.8 μg/mL]에 항균활성을 나타냈다. 본 연구 결과, 참담치 혈구 유래 mytilin B1과 mytilin B2는 넓은 항균 스펙트럼을 가지고 열과 염분에 대한 안정성이 높으며 용혈현상과 세포독성은 나타나지 않았다. 다섯 번째 연구에서 참담치의 외투막에서 분리된 myticusin-beta는 11 kDa의 24개 아미노산 잔기의 signal peptide와 104개의 mature peptide로 구성된 574bp, 128개 아미노산 잔기로 밝혀졌으며 재조합 단백질 제작으로 그람 양성균주 (B. cereus, B. subtilis, Clostridium perfringens, S. aureus, Streptococcus iniae, S. mutans) 와 그람 음성균주 (E. coli, P. aeruginosa, Vibrio alginolyticus, K. pneumoniae) 에 대해서 항균 활성을 보임을 확인하였다. 뿐만아니라 정제된 재조합 단백질은 항 기생충 활성을 보이기도 하였다. 서열정보를 바탕으로 항균 활성이 강화된 유도체를 제작하여 항균 활성 및 안정성을 확인하였으며 조직적 정량적 분석을 통해 외투막에서 가장 높게 발현됨을 밝혔다. 여섯 번째 연구에서 돌돔의 CDP, LBP 유전자의 native form을 기반으로 하여 항균활성과 기능이 증가되고 독성이 감소한 유도체를 제작하기 위하여 아미노산 잔기 치환, 펩타이드 말단 변형 방법을 사용하였다. 제작한 유도체들의 항세균, 항기생충 활성은 증가하거나 유지되었으며 LBP 5A 유도체들은 항균활성은 증가하고 용혈활성은 감소하였지만 항기생충, 항암활성은 감소하였다. CDP A2의 경우 유도체들은 항균활성 이외 활성은 낮거나 비슷하였다. LBP 5A 는 항균 활성이 강하여 N말단의 acetylation과 C말단의 amidation으로 활성과 안정성이 증가한 항균 펩타이드를 개발하였다. 본 연구 결과들을 통해 참담치에서 분리한 항균 펩타이드 mytichitin-CBD, protamine-like protein, McSSP-31, mytilin B1, mytilin B2, myticusin 들은 넓은 항균 스펙트럼과 열과 염분에 대한 높은 안정성으로 기능성 사료첨가제 및 항생제 대체제로써 충분히 안정적인 역할을 할 뿐만 아니라 추후 항균 펩타이드의 구조적 중요성과 참담치의 면역학적 측면에서 해양무척추동물의 선천성 면역 기작에 대한 정보를 제시할 것으로 사료된다. 그리고 돌돔의 CDP, LBP 펩타이드 유도체개발을 통해 분자량과 독성은 낮고 항균활성, 투과성, 다기능성, 안정성을 증가된 물질로 새로운 항균 기능성 소재로 사료첨가제로 활용 가능한 것으로 보인다.