바다 송사리(Oryzias dancena) 정소 조직배양에서 정원세포 증식을 위한 배양 조건 최적화

Abstract

Spermatogenesis is the process of creating male gametes. Realizing this in vitro is quite worthwhile because it can be used as an useful model to study spermatogenic regulation. To date, many studies have been conducted to induce in vitro spermatogenesis. Especially, the study dealing with mouse succeeded to produce healthy offspring through testis organ culture. In case of marine medaka (Oryzias dancena), although in vitro spermatogenesis through testis organ culture was induced, it was maintained only during early phase of culture indicating that the culture condition was not optimal. Therefore, this study was conducted to optimize the conditions for testis organ culture in marine medaka in terms of spermatogonial proliferation. In order to do that, several factors in culture including culture temperature, basal media, and medium supplements were applied differently to testis organ culture and then spermatogonial proliferation within the cultured testes was examined by BrdU incorporation assay after culture for 4 days. As the results, significant adverse effect in spermatogonial proliferation was observed at 30℃ culture condition compared to 26℃ or 28℃ condition. In case of basal media, Dulbecco's Modified Eagle Medium and Minimum Essential Medium α (α-MEM) were more effective for the maintenance of spermatogonial proliferation than Leibovitz's L15 (L15). Use of KnockOut™ Serum Replacement (KSR) instead of fetal bovine serum (FBS) showed a significant positive effect on the maintenance of spermatogonial proliferation. Finally, addition of 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one in culture media did not show any significant effect on spermatogonial proliferation in culture. Next, three genes including nanos2, anti-Müllerian hormone (amh), steroidogenic acute regulatory protein (star) were isolated as the marker genes specific to spermatogonia, Sertoli cells, and Leydig cells, respectively and the expression level of each genes in the cultured testes was evaluated by semi-quantitative RT-PCR. As the results, the expression levels of amh and star were significantly high in the optimized culture condition consisting of α-MEM and KSR compared to the initial one that was comprised of L15 and FBS. In nanos2 and scp3, relative high expression was observed in the optimized culture condition compared to the initial one, but statistical difference was not detected in both genes. These data indicate that the condition optimized in this study had a favorable influence on the maintenance of spermatogonial proliferation in testis organ culture by maintaining the role of Sertoli cells and Leydig cells. From this study, the optimized condition for a whole testis organ culture in terms of the maintenance of spermatogonial proliferation was established. The results from this study will provide basic data for the study of inducing marine medaka spermatogenesis in vitro.

정자 형성과정은 수컷 배우자를 만들어내는 과정으로, 이를 체외에서 구현할 수 있다면 정자 형성과정 조절 연구를 위한 유용한 모델로써 활용될 수 있다. 현재까지 체외 정자형성과정을 유도하기 위해 여러 연구들이 수행 되어왔다. 특히, 쥐를 이용한 연구에서 정소 조직배양을 통해 건강한 자손을 생산하는데 성공한 바 있다. 바다 송사리의 경우, 정소 조직배양을 통한 체외 정자형성 유도가 확인된 바 있으나 배양 초기에만 정자형성과정이 유지 되었고, 이는 배양 조건이 최적화되지 않았다는 것을 의미한다. 따라서 본 연구는 정원세포 증식의 관점에서 바다 송사리(Oryzias dancena) 정소 조직배양을 위한 배양 조건 최적화를 위해 수행되었다. 이를 위해 배양 온도, 기본 배지, 배지 첨가물과 같은 몇몇 요인들을 정소 조직배양에 다르게 적용하였고, 배양 4일 후에 BrdU incorporation assay를 통해 배양된 정소에서 정원세포 증식능을 확인하였다. 그 결과, 26℃ 또는 28℃ 조건과 비교하였을 때 30℃ 배양 조건에서 정원세포 증식에 매우 부정적인 효과를 나타내었다. 기본 배지의 경우, Leibovitz's L15를 이용하였을 때 보다 Dulbecco's Modified Eagle Medium 와 Minimum Essential Medium α를 이용하였을 때 정원세포 증식 유지에 보다 효과적이었다. Fetal bovine serum을 대신하여 KnockOut™ Serum Replacement를 이용하였을 때 정원세포 증식 유지에 매우 좋은 효과를 보였다. 마지막으로, 배양 배지에 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one를 첨가하였을 때 배양에 있어서 정원세포 증식에 아무 효과가 없다는 것을 확인하였다. 다음으로 정원세포, 세르톨리 세포, 라이디히 세포에 특이적인 마커 유전자로써 각각 nanos2, anti-Müllerian hormone (amh), steroidogenic acute regulatory protein (star)를 분리하였고, 배양된 정소에서 각 유전자의 발현량을 semi-quantitative RT-PCR를 통해 비교·평가하였다. 그 결과 amh와 star 유전자는 기존 배양 조건에 비해 최적 배양 조건에서 유의적으로 강하게 발현하였고, nanos2와 scp3 유전자의 경우, amh와 star 유전자와 유사한 발현 양상을 나타내었으나 두 조건 간 유의적인 차이를 나타내진 않았다. 이는 본 연구에서 확립한 최적 배양 조건이 배양조직 내 세르톨리 세포와 라이디히 세포의 역할을 유지하고 이를 통해 정원세포의 증식능 유지에 기여한다는 것을 의미한다. 본 연구를 통해 바다 송사리의 정소 조직배양에 있어 정원세포의 증식능 유지를 위한 보다 최적화된 조건을 확립하였다. 본 연구를 통한 결과들은 바다 송사리에서 정자형성과정 조절 연구를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.