Fish biodiversity in the Coral Reef of Java Island, Indonesia by Genomic Analysis

Abstract

요약 산호초는 가장 생산적이고 풍부한 생물 다양성 생태계입니다. 그 범위는 비교적 작으며, 바다 표면의 약 0.2 %가 전 세계에 분포되어있다. 그러나 거의 25 %의 해양 생물과 거의 4,000 종의 해양 생물이 산호초를 서식지로 사용하고 있습니다. 그 생태계는 전 지구 적 기후 변화, 지역 인위적 활동, 파괴적인 어업 활동 및 증가 된 퇴적물에 의해 손상되었습니다. 산호초 어류의 풍부 성과 다양성에 중요한 영향을 미친다. 중요한 생태계 기능을위한 어류의 생물 다양성. 세계적인 중요성으로 인식되어 해양 생태계의 관리에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 해양 습관은 계속해서 압력을 가중시키고 있으며, 생물 다양성 보전에 대한 책임과 지속 가능한 개발을위한 관리를 책임지고 있습니다. 따라서 생물 다양성 조사는 환경 관리에 대한 기본 정보를 제공하기 위해 적용되었습니다. 서인도 제도와 타부 한 섬은 산호초 생태계 인 자바 해에 위치하고 있습니다. 그것은 인도네시아 군도 지방의 핫스팟 어류 생물 다양성으로보고되었습니다. 또한 두 지역의 생물 다양성은 생태계에 대한 재화와 서비스를 제공하고 1960 년 이래 수산 식품과 관상용 어류에 이용되었습니다. 그러나 지난 10 년 동안 사우 전 섬의 산호초는 어류의 다양성이 크게 악화되고 감소했습니다. 1984 년부터 2018 년까지 UVC (Underwater Visual Census)와 물고기의 후원하에 생물 다양성 연구가 특징적으로 취약하고 현재 특별한 어려움이 있음이 확인되었습니다. 연구자들은 총 479 종의 물고기를 기록했다. 또 다른 연구원은 2016 년에 29 종의 216 종을 확인했습니다. 또한, IUCN 레드리스트 데이터베이스에 따르면 292 종은 최소 관심사로, 143 종은 평가되지 않음으로 표시되었습니다. 희귀 한 어류는 Elasmobranchii의 하위 분류에서 7 종을 포함하여 거의 위협 받고 취약한 것으로 분류되었습니다. 반대로, 타 부한 (Tabuhan) 섬의 생물 다양성 연구에 관한 많은 정보가 발견되었는데, 14 군데의 어류 34 종과 Bangsring 해안에서 가장 가까운 곳인 바 누유이 (Banyuwangi)에서 가장 가까운 생물로보고 된 종 중 하나. 확인 된 어종은 전형적으로 그 형태 학적 특성에 기반을두고 있기 때문에 불명확 한 식별, 잘못 표기된 데이터베이스 및 데이터베이스에 정보가 없기 때문에 속 40 종을 확인했다. 최근의 연구에서 DNA 시퀀싱은 합리적인 생물 정보학 및 단순화 된 분석을 제공하고 비밀 종을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 연구원은 총 미토콘드리아 DNA, 특정 종의 DNA 바코드 및 다른 분자 정보의 시퀀싱을 통해 생물 다양성 종을 분석 할 수 있습니다. 전체 미토콘드리아 DNA가 잘 결정된 비밀스런 종의 긴 서열에도 불구하고 미토콘드리아 DNA의 짧은 서열은 유전 적 마커 및 생물 다양성 조사에 유리하다. COI 서열은 보존 된 단백질 암호 유전자이며, 표준 유전자 마커 및 신속한 단일 종 식별을위한 DNA의 종으로 사용되었다. 그러나, COI 서열은 환경 DNA (eDNA)로부터의 불순물, 혼합물, 분해 된 단편 DNA 및 벌크 샘플을 확인하는데 덜 효과적이다. 또한 내부 전사 된 스페이서 (ITS)는 2 개의 보존 된 유전자 인 12SRNA와 16sRNA 사이의 순차적 서열이다. 그것은 일반적으로 유전 연구에 사용되며 대량 다양성 샘플 또는 eDNA에서 성분을 특성화하는 데 잠재적으로 효과적입니다. COI 서열이 표준 DNA 바코딩 종으로 이용 되었기 때문에 많은 수의 COI 서열 데이터베이스가 GenBank에 기탁되었다. 그러나, 몇몇 ITS 서열 데이터베이스가 기탁되었다. 이러한 이유로 우리는 인도네시아 자바 해역의 산호초에서 수집 한 신원 확인 지표로 COI 영역을 생성했습니다. COI 서열의 길이는 588-682 bp이며, ITS 서열은 583-1123 bp이다. 그것의 순서는 120 종, 78 주, 30 가족 다섯 주문을 대표하고, 우리는 87 개의 새로운 ITS 데이터베이스 시퀀스와 기존의 DNA 바코드 참조를 풍부하게하는 5 개의 시퀀스를 가지고 있습니다. ITS 서열은 2 개의 보존 유전자 (12S rRNA 및 16s rRNA)를 포함하고 있으며, tRNAval은 표적 유전자를 증폭시키기에 충분한 초 가변 뉴클레오타이드를 보여 주며, 밀접한 관련성이있는 동종 어류를 식별하기에 충분한 뉴클레오타이드 변이를 함유한다. 또한 Chordata의 1,846 염기 서열을 3484 bp의 ITS 서열을 표적으로하고 물고기 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 서열의 MiFish 1 차 표적 단편 (163 ~ 185 bp 길이)과 비교하여 eDNA 샘플에서 물고기의 다양성. 결과적으로 1 차 MiFish는 기본 화음 (84,230 판독 및 115 OTU)과 비교하여 더 높은 판독 및 OTU 수 (105,860 판독 및 146 OTU)를 획득했습니다. 데이터베이스의 MiFish 주요 영역을 다루는 서열 수가 더 많기 때문에 합계 91.7 %의 병합 읽기 (130 OTUs)가 어종으로 묘사되었습니다. 대조적으로, 58.3 % 병합 읽기 (74 OTUs)는 물고기로 기술되었으며 39.7 % 합병 된 읽기 (37 OTU)는 기본 코드에 의해 알려지지 않은 물고기 종으로 확인되었습니다. MiFish 프라이머에 의한 어종의 분류 학적 구성은 하나의 서브 클래스, 8 개의 주문, 31 개의 계열 및 60 개의 장으로 구성된 130 종을 나타냈다. Chord Primary는 두 가지 하위 클래스, 9 개의 주문, 31 개의 가족과 60 개의 속을 포함하는 74 종을 대상으로했습니다. MiFish 프라이머 세트와 달리, Elasmobranchii의 3 종은 주로 Chord set에 의해 독점적으로 검출되었습니다. MiFish 프라이머 세트의 짧은 서열은보다 긴 프라이 머리 코드 서열보다 더 높은 종 다양성을 보였다. 그러나 두 가지 주요 세트는 이전의 연구보다 더 높은 다양성으로 생산되어 Thousand Islands의 숨겨진 물고기 다양성을 드러 냈습니다. 결론적으로, 우리는 eDNA 메타 코딩을 위해 설정된보다 긴 주 코드 줄을 개발했습니다. ITS 서열 데이터베이스에는 데이터가 부족하지만,이 프라이 머리 세트는 더 높은 해상도를 나타내고, MiFish 프라이머와 비교하여 Elasmobranchii 군을 검출 할 수있게한다. 잠재적으로 산호초 어류 생물 다양성 조사를위한 대체 어류, 비 침습적 방법을 분석하는 도구로 사용됩니다.

Abstract Coral reefs are the most productive and rich biodiversity ecosystem. Their extent is relatively small, around 0.2 % of ocean surface were distributed around the world. However, almost 25 % of marine species and nearly 4,000 marine fish species are using coral reef as their habitat. Its ecosystem is now has been damaged by the global climatic changes, local pressure caused by the anthropogenic activity, destructive fishing practices, and increased sedimentation. It results in a significant impact on the abundance and diversity of coral reef fishes. Fish biodiversity has important parameters for marine ecosystem function. It is recognized to be global importance and becomes of increasing concern in the management of the marine ecosystem. Since the marine habitats continue to be under increasing pressure, its driving responsibility for conserving biodiversity and for managing development for the sustainable way. Hence, a biodiversity survey was applied to provide basic information for environmental management. Thousand Islands and Tabuhan Island located in the Java Sea, it is a coastal area with coral reefs ecosystem. It has been reported as Indonesian archipelago local hotspot reef fish biodiversity. Furthermore, the biodiversity of both locations provided goods and service to the ecosystem and exploited since 1960 for fisheries product and ornamental fish. However, in the last decade, Thousand Island’s coral reef experienced high degradation and reduction in the fish diversity. During the period from 1984 to 2018, the biodiversity research in the Thousand Islands extensively employed underwater visual censuses (UVC) and fishes identified visually to the level of species taxonomy based on its morphological characteristics as reef ecosystem are characteristically fragile and present special difficulties. The researchers recorded a total of 479 species of fish. In the year of 2016, another researcher identified 216 species of 29 families. Furthermore, according to the IUCN red list database, 292 species were listed as Least Concern and 143 as Not Evaluated. Twelve rare fish species were listed as Near Threatened and vulnerable including seven species from a subclass of Elasmobranchii. On the contrary, a few information of biodiversity research in Tabuhan Island was found, 34 fish species of 14 families and one near threatened species were reported in Bangsring coast, Banyuwangi as the closest location. Since fish species identified visually based on its morphological characteristics, 40 species were identified at the genus level due to unclear identification, mislabeled and even no information in the database. In a recent study, DNA sequencing and bioinformatics provide cheaper and simplified analysis and enable to identify cryptic species. Consequently, researchers can analyze the species biodiversity by sequencing of total mitochondrial DNA, DNA barcodes from specific species and another molecular information. Despite the long sequence of total mitochondrial DNA well determined the cryptic species, a short sequence of mitochondrial DNA has advantageous to genetic marker and biodiversity survey. The COI sequence is a conserved protein-coding gene and was used as species DNA barcoding for the standard genetic marker and rapid single species identification. However, the COI sequence less effective to identify impurity, mixture, degraded, short, fragmented DNA and bulk sample from environmental DNA (eDNA). Furthermore, the Internal transcribed spacer (ITS) is a less conserved sequence which is situated between two conserved genes, 12SRNA and 16sRNA. It is commonly used for genetic population study and potentially effective to characterized species composition in bulk diversity sample or eDNA. Since COI sequence utilized as standard species DNA barcoding, a large number of COI sequence database was deposited in GenBank. However, a few ITS sequence database were deposited. For this reason, we generate ITS database of fish collected from a coral reef in Java Sea, Indonesia and using COI region as an identity marker. The COI sequence ranged from 588-682 bp in length and the ITS sequence ranged from 583-1123 bp in length. Its sequence representing 120 species, 78 genera, 30 family and five orders, and we added a total of 87 new ITS sequence database and five new COI sequences to enrich the existing reference of DNA barcode. The ITS sequence contains two conserved genes (12S rRNA, and 16s rRNA), and tRNAval showed hypervariable nucleotide were adequate to amplify the target gene and contain sufficient nucleotide variation to discriminate closely related congeneric fish species. Furthermore, we designed the Chord primer by aligning 1,846 sequences from Chordata, targeting a fragment (344 bp in length) of ITS sequence and compare with MiFish primer targeting fragment (163 to 185 bp in length) of fish mitochondrial 12S rRNA gene sequence to obtain fish diversity in eDNA sample. As a result, MiFish primer obtained higher reads and OTUs number (105,860 reads and 146 OTUs) compared with the Chord primer (84,230 reads and 115 OTUs). Due to the higher numbers of sequences covering the MiFish primer regions in the database, a total 91.7 % merged reads (130 OTUs) were described as fish species. In contrast, only 58.3% merged reads (74 OTUs) were described as fish, and 39.7% merged reads (37 OTUs) were identified as unknown fish species by Chord primer. The taxonomic composition of fish species by MiFish primer exhibited 130 species consisting one subclass, eight orders, 31 families and 60 genera. while Chord primer covered 74 species comprising two subclasses, nine orders, 31 families and 60 genera. Different from MiFish primer set, three species of two family in Elasmobranchii were detected exclusively by Chord primer set. The short sequence of MiFish primer set showed a higher species diversity than the longer sequence of chord primer set. However, both primer sets resulted in higher diversity than the previous study and revealed hidden fish diversity in the Thousand Islands. In conclusion, we developed a longer sequence of chord primer set for eDNA metabarcoding. Although there is a lack of data in the ITS sequences database, this primer set exhibited higher resolution and enable to detect Elasmobranchii group compare to the MiFish primer. It is potentially used as a tool to analyze fish diversity and could serve as an alternative, non-invasive method for coral reef fish biodiversity surveys.