Analysis of microbial community structures in the East Sea (Sea of Japan) using next-generation sequencing technology

Abstract

Since microorganism, including numerous phytoplankton and bacteria, play an essential role as a functional backbone in aquatic ecosystems, it is important to understand their community changes induced by the various ecological events. In the East Sea (Sea of Japan), the East Korea Warm Current (EKWC) from south and North Korea Cold Current (NKCC) from north merge together forming a complicate and highly productive water containing several kg/m2 of biomass. In order to understand the changes of the microbial communities in the complicate marine ecosystem, we established a monitoring system by the molecular tools. A qPCR method was used for quantitative analysis of both total microorganism (16S universal primers) and phytoplankton (plastid 23S universal primers). The reliability of the method was confirmed by both qPCR and NGS results of several water samples collected from the East Sea. As the result of 423 waters from 22 sample sites, the highest copy numbers of total microorganism and phytoplankton were identified on the surface water in April and May, respectively. The biomass of phytoplankton increased first from the southeastern water (Jukbyeon) in March to the northeastern (Daejin) in June. As the result of two NGS analyses amplified by 16S and p23S primers, 2,573 microbial OTUs (35 phyla) and total 891 phytoplankton OTUs (17 phyla) were identified, respectively. Different from those generated by 16S universal primers, only 23.1 % of total OTUs by p23S showed more than 98 % or higher sequence identity to GenBank database requiring a higher amount of sequence data for the region. The dominant microbial and phytoplankton species on the surface water changed by season, while those of waters at 100 m showed a stable community structure. We were also able to identify the correlations between microbial communities and seasons or depths. In the second part of the dissertation, we compared the phytoplankton community structures generated by two currently used universal primers (18S and p23S). The major difference was the low numbers of dinoflagellates in the phytoplankton community generated by p23S primers compared with those generated by 18S primers. Since half of the dinoflagellates are known to be capable of photosynthetic, we also measured the eukaryotic community structures in the East Sea using 18S primers. A total of 2,290 eukaryotic OTUs (37 phyla) were identified, including arthropods, dinoflagellates, ciliates and phytoplankton. Mamiellophyceae was dominated in January whereas dinoflagellate was most abundant in June. Although the number of dinoflagellate OTUs generated by 18S primers (974 OTUs) was higher than those by p23S primers (41 OTUs), most of them were mixotrophic dinoflagellates. We failed to assign a genus name for those generated by 18S universal primer set due to the lack of references in the database. On the other hand, the p23S primers can selectively detect three types of photosynthetic dinoflagellates, which are considered to actually function as photosynthesis by chloroplast or kleptoplastid. Therefore, we conclude that plastid 23S rRNA gene can be a powerful alternative marker for analyzing the phytoplankton community structure including the photosynthetic dinoflagellates, whereas the 18S primers can be used for the analysis of total eukaryotic taxa. Comparative analysis of myzozoan taxa analyzed by those two primers would help us to obtain the information of their complicate ecological status in the marine ecosystem. In addition, we expect that these results analyzed by three universal primer sets (16S, p23S, and 18S) would provide the useful information for understanding the spatial and temporal changes in the pelagic ecosystem of the East Sea.

수 많은 식물플랑크톤과 박테리아를 포함하는 미생물은 해양 생태계 구조의 기본적인 토대를 이루는 중요한 역할을 하기 때문에 다양한 환경 변화에 따른 미생물 군집구조의 변화를 이해하는 것이 중요하다. 해양 생태계 내에서 미생물 군집의 변화를 파악하기 위해 2개의 프라이머 세트 (미생물 분석을 위한 16S 프라이머와 식물플랑크톤 분석을 위한 색소체 23S 프라이머 (p23S))를 이용하여 qPCR 정량 분석 방법을 확립하였다. 이 분석 방법의 신뢰성은 동해에서 채집한 해수 샘플의 qPCR 및 차세대 시퀀싱 (NGS) 분석을 통해 검증되었다. 종속영양 박테리아는 4월 표층수에서 가장 많았고, 식물플랑크톤은 5월 표층수에서 가장 많았다. 식물플랑크톤의 양은 3월에 남쪽 해역인 죽변에서 증가하기 시작하여 북쪽 해역인 대진으로 점차 확장됨을 확인하였다. 16S 및 p23S 프라이머 세트와 MiSeq 플랫폼을 이용한 군집구조 분석 결과, 총 2,573개의 미생물 OTUs (operational taxonomic units) (35개 문)와 총 891개의 식물플랑크톤 OTUs (17개 문)를 얻었다. 16S 프라이머 세트를 이용한 결과와는 달리 p23S 프라이머 세트로 얻은 전체 OTUs 중에서 23.1% 만이 GenBank 데이터베이스와 98% 이상의 염기서열 동일성을 보였다. 따라서 더 좋은 결과를 얻기 위해서는 더 많은 색소체 23S rDNA 데이터베이스가 축적되어야 한다. 군집구조 분석 결과, 표층수에서 가장 우점한 식물플랑크톤은 1월에 Ostreococcus tauri 였고 6월에 Synechococcus sp.로 계절의 변화에 따라 우점종이 천이되었다. 표층수에서 우점 박테리아 또한 1월에 Candidatus Pelagibacter에서 6월에 Synechococcus sp.로 천이됨을 확인하였다. 또한 군집구조 분석을 통해 4월에 수층의 성층화가 시작됨을 알 수 있었고, 조사기간 동안 표층수의 식물플랑크톤 군집구조는 계절의 변화에 따라 계속 변했지만 수심 100 m 에서는 안정적이었음을 확인하였다. 둘째로, 식물플랑크톤 군집구조 연구에 현재 주로 사용되고 있는 18S 프라이머 세트와 p23S 프라이머 세트를 이용한 분석 결과를 비교하여 이들의 차이점을 확인하였다. 두 프라이머 세트의 주요 차이점은 18S 프라이머 세트에 비해 p23S 프라이머 세트로 얻은 식물플랑크톤 OTUs에서 현저하게 적은 와편모조류의 수였다. 와편모조류의 약 절반이 광합성을 수행할 수 있다고 알려져 있기 때문에, 18S 프라이머 세트를 사용하여 동해에서 와편모조류를 포함하는 진핵생물의 군집구조를 분석하였다. 그 결과, 총 2,290개의 진핵생물 OTUs를 얻었으며 이들은 최종적으로 절지동물, 와편모조류, 섬모충류, 식물플랑크톤 등을 포함하는 37개 문으로 분류되었다. 1월 표층수에서는 Mamiellophyceae가 6월 표층수에서는 와편모조류가 가장 우점했다. 비록 18S 프라이머로 얻은 와편모조류 OTU의 수가 p23S 프라이머로 얻은 수보다 23.8배 많았지만, 대부분이 혼합영양성 와편모조류였다. 또한, 참조 데이터베이스의 부족으로 인해 18S 프라이머로 얻은 OTUs에 속명을 명명할 수 없었다. 반면에 p23S 프라이머는 3차 공생을 통해 얻은 색소체 또는 절취색소체 (kleptoplastid)로 실제로 광합성을 수행하는 광합성 와편모조류의 세 가지 유형을 선택적으로 검출 할 수 있었다. 결론적으로, 색소체 23S rRNA 유전자는 광합성 와편모조류를 포함한 식물플랑크톤의 군집 구조를 분석하기 위한 강력한 대안 마커가 될 수 있는 반면에 18S 프라이머는 전체 진핵생물 분류군을 분석하는데 사용되어야 한다고 사료된다. 또한, 두 프라이머를 이용한 myzozoan 분류군의 비교 분석은 해양 생태계에서 이들의 복잡한 생태학적 상태를 이해하는 데 도움이 될 것이며, 세 가지 프라이머 세트 (16S, p23S, 18S)에 의해 분석된 결과는 동해 표영생태계의 시·공간적 변화를 이해하는데 유용한 정보를 제공해 줄 것으로 기대된다.