Optimized pretreatment conditions for the environmental DNA (eDNA) analysis of Apostichopus japonicus

Abstract

A non-destructive protocol for the analysis of sea cucumber (Apostichopus japonicus) resources using environmental DNA technique was established. Choice of the DNA extraction kits, among the commercial DNA extraction kits used, the DNeasy® Plant Mini Kit is considered to be the best choice for separating the mucous environmental DNA of sea cucumber. As the temperature and incubation time increased, the amount of extracted environmental DNA was also large, but it was judged that the increased amount did not affect as much as 2-3 times. Therefore, these conditions were not considered to be the main factors to consider in actual environmental DNA extraction. However, the amount of seawater relative to the size of the sample was judged as a major consideration, and a sufficient amount of environmental DNA for analysis was secured when stored within 5 minutes while stirring the volume of seawater corresponding to the total sea cucumber weight (g). In securing the environmental DNA of sea cucumbers, the mortality rate of sea cucumbers in all experiments was 0, and it was judged that the effects of sea cucumbers were not significant through this treatment. Through the results of this study, sea cucumber DNA research, which has been conducted in a destructive method, can be conducted non-destructively through environmental DNA analysis. Through this study, we have secured a standard protocol that can successfully extract the sea cucumber DNA through environmental DNA. It is not only excellent in terms of time and cost of traditional DNA analysis method currently used, but it is completely non-destructive in the ecosystem of the survey area. It is believed that the system can be transformed in a way that does not affect it. However, it is thought that various standard protocols should be established considering the characteristics of each type.

해양생태계를 보존하며 지속적이며 과학적인 수산자원관리를 위하여 해삼(Apostichopus japonicus)으로부터의 환경유전자를 분리하는 방법의 최적 프로토콜을 본 연구를 통해 구축하였다. 사용된 상업적 유전자 추출키트 중 DNeasy® Plant Mini Kit가 해삼의 점액질 환경유전자를 분리하기 위한 최상의 선택이라 판단된다. 온도와 배양시간이 증가함에 따라 추출되는 환경유전자의 양도 많았으나 각 개체마다 많은 차이로 인해 통계적으로 유의한 차이는 없어 크게 영향을 끼치지 않는다고 판단된다. 따라서 이런 조건들은 실제 환경유전자 추출에 있어서 주요 고려 요인이 아닌 것으로 판단된다. 다만 샘플의 크기에 대한 해수의 양이 주요 고려사항으로 판단되며 전체 해삼 무게(g)에 해당하는 부피의 해수를 교반 시키며 5분이내에 보관할때 분석하기 위한 충분한 양의 환경유전자를 확보할 수 있었다. 해삼의 환경유전자를 확보하는 모든 실험에 있어 해삼의 치사율은 0으로 본 처리를 통하여 해삼에게 미치는 영향은 크지 않은 것으로 판단된다. 본 연구의 결과를 통해 지금까지 파괴적 방법으로 진행해왔던 해삼 유전자 연구를 환경유전자 분석법을 통하여 비파괴적으로 진행할 수 있다. 본 연구를 통해 환경유전자를 통하여 해삼의 유전자를 성공적으로 추출할 수 있는 표준 프로토콜을 확보하였으며 기존에 사용되어왔던 유전자 분석 방법의 시간과 비용측면에서 우수할 뿐만 아니라 조사지역의 생태계에 전혀 영향을 주지 않는 비 파괴적인 방법으로 제도의 변환이 가능할 것으로 판단된다. 다만 종별 특성을 고려한 다양한 표준 프로토콜이 확립되어야 할 것으로 생각된다.