Characterization of KPC-2 carbapenemase producing Enterobacteriaceae and test for interspecies transferability

Abstract

The prevalence of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) is increasing globally, resulting in high mortality rates. Although CRE is a relatively recent problem in Korea (the first case was not diagnosed until 2010), it is responsible for serious morbidities at an alarming rate. The incidence of CRE and carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPE) at a general hospital in Korea between August 2017 and August 2019. Forty strains of CPE were isolated from various clinical specimens and analyzed via antimicrobial susceptibility test, PCR detection of the β-lactamase genes, multilocus sequence typing, genomic sequencing, curing, and conjugational transfer of plasmids. All 40 isolates were multidrug-resistant and 75% of the Enterobacteriaceae isolates were resistant to ciprofloxacin whereas 72.5% were resistant to trimethoprim-sulfamethoxazole. Conjugation accounted for 57.5% of all resistant plasmid transfer events, which is 4.3-fold higher than that observed in 2010. The high detection rate of transposon Tn4401 (34/40, 85%) was associated with the rapid diffusion and evolution of CPE. The horizontal propagation pathway CPE between different bacterial species was studied by using high-risk clone of E. coli (CPEc171209, ST410) and Klebsiella pneumoniae (CPKp171210, ST307) sequentially isolated from one patient. CPEc171209 harbored five plasmids belonging to serotype O8:H21, which is in the antimicrobial-resistant clade C4/H24. The CPKp171210 isolate harbored three plasmids. Both strains harbored various additional antimicrobial resistance genes. The IncX3 plasmid pECBHS_9_5 harbored blaKPC-2 within a truncated Tn4401a transposon, which also contains blaSHV-182 with duplicated conjugative elements. This plasmid displayed 99% identity with the IncX3 plasmid pKPBHS_10_3 from the K. pneumoniae CPKp171210. The genes responsible for the conjugal transfer of the IncX3 plasmid included tra/trb clusters and pil genes coding the type IV pilus. Three KPC-2 producing Enterobacteriaceae were sequentially isolated from one patient and characterized. K. pneumoniae (CPKp1825) ST 307 was isolated first followed by Klebsiella aerogenes (CPEa1826) and Escherichia coli (CPEc1827) within a month. These stains were analyzed by antimicrobial susceptibility, PCR detection of the β-lactamase genes, multilocus sequence typing, curing, and whole-genome sequencing. Sequence analysis revealed that all three strains contain two plasmids per each, which were able to be transferred through conjugation by using the type IV secretion system, pilus genes, and tra genes encoded by the plasmid. The blaKPC-2 gene was located in the transposon Tn4401a on incurable IncX3 plasmids pKPBHS_25_2, pEABHS_26_2 and pECBHS_27_1 of CPKp1825, CPEa1826 and CPEc1827, respectively. However, partial deletion was observed in the Tn4401a on pEABHS_26_2 and pECBHS_27_1, which indicated the horizontal transfer from pKPBHS_25_2 in CPKp1825, Our results highlight the rapid emergence of extensively drug-resistant strains in Korea. Furthermore, the presence of the blaKPC-2 on plasmid that can be horizontally transferred among bacterial species by conjugation as probed or observed in this study emphasize the need for employing urgent control measures and protocols at the national level.

항생제 내성 박테리아의 출현은 항생제 사용 빈도가 증가한 후 전 세계적으로 심각한 문제가 되었다. 특히 Carbapenem 내성 장내세균 (carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)의 경우 국내에서는 2010년에 최초로 보고되었으나 의료 환경에서 빠르게 확산하는 경향을 보여 더 큰 위협이 되고 있다. 이에 최근 2년간의 단일기관에서의 카바페넴 효소 생성 장내세균 (carbapenemase-producing Enterobacteriaceae, CPE) 분포양상과 항생제 내성비율을 조사하였으며 이 중 종간 전파양상을 보인 5균주를 선택하여 플라스미드 및 전체 게놈 서열을 분석 비교하였다. 또한, KPC를 생성하는 장내세균으로부터 KPC 전파 클론의 특성과 플라스미드를 통한 blaKPC의 수평 이동에 관해 연구하였다. 2017년 8월부터 2019년 8월까지 국내 단일 종합병원에서 분리한 CRE와 CPE를 조사하였다. 다양한 의료용 시료로부터 40 균주의 CPE가 분리되었으며, 이들에 대하여 항생제 감수성, β-lactamase 유전자 검출을 위한 PCR, 다좌위 서열 형별분석 (Multi Locus Sequence Typing, MLST), 게놈 염기서열 분석, curing, 접합에 의한 플라스미드 전달 분석이 이루어졌다. 40 균주 모두 다제 내성을 가지고 있었으며, 장내세균의 균주의 75% ciprofloxacin에 내성을 보인 반면 72.5%는 trimethoprim-sulfamethoxazole에 대한 내성을 나타내었다. 접합에 의한 플라스미드 수평 전달은 성공적으로 이루어졌으며 (23/40, 57.5%), 이는 2010년에 보고된 접합 성공률과 비교하면 4.3배 높은 수치로서 카바페넴 저항성 확산의 가능성을 보여 준다. 또한, 트랜스포존 Tn4401의 높은 검출빈도 (4/40, 85%)는 CRE의 빠른 전파와 균 진화의 가능성을 제시한다. CPE의 서로 다른 세균 종간의 수평적 이동을 동일환자로부터 순차적으로 분리된 고위험 클론 대장균 (CPEc171209, ST410)과 Klebsiella pneumoniae (CPKp171210, ST307)를 이용하여 조사하였다. CPEc171209 혈청형 O8:H21이고 항생제 내성 클래이드 C4/H24에 속하며, 5개의 플라스미드를 가지고 있다. CPKp171210는 3개의 플라스미드를 가지고 있었다. 두 균주 모두 다양한 항생제 내성 유전자를 추가적으로 가지고 있다. IncX3 계열의 플라스미드 pECBHS_9_5는 불완전한 형태의 트랜스포존 Tn4401a 안에 blaKPC-2를 포함하고 있으며, 중복된 접합인자와 blaSHV-182를 포함하고 있다. 이 플라스미드는 K. pneumoniae CPKp171210로 분리된 IncX3 계열의 플라스미드 pKPBHS_10_3와 99% 일치하였다. 이 플라스미에는 또한 IncX3 계열의 플라스미드의 접합 전달에 필요한 tra/trb 클러스터, type IV pilus.를 암호화하는 pil 유전자 등이 존재하여 접합에 의한 KPC-2 유전자의 수평적 전이를 가능하게 한다. KPC-2를 생산하는 장내세균 세 균주를 동일한 환자로부터 순차적으로 분리하여, 이들의 분자생물학적 특성 및 KPC-2 유전자의 수평적 전달 과정을 조사하였다. K. pneumoniae (CPKp1825) ST 307가 최초로 분리되었으며, 그 후 K. aerogenes (CPEa1826)와 Escherichia coli (CPEc1827)가 차례로 분리되었다. 이들 균주에 대하여 항생제 감수성, β-lactamase 유전자 검출을 위한 PCR, 다좌위 서열 형별분석 (Multi Locus Sequence Typing, MLST), 게놈 염기서열 분석, curing, 접합에 의한 플라스미드 전달 분석이 이루어졌다. 게놈 분석 결과 각 균주 모두 2개씩의 플라스미드를 가지고 있었으며, 이들은 플라스미드에 포함되어있는 제4형 분비 체계, pilus 유전자, tra 유전자 등에 의하여 접합을 통하여 전달될 수 있었다. blaKPC-2 유전자는 CPKp1825, CPEa1826와 CPEc1827에서 각각 분리된 pKPBHS_25_2, pEABHS_26_2, 그리고 pECBHS_27_1 플라스미드에 위치하는 트랜스포존 Tn4401a에 위치하였다. 특히 플라스미드 pEABHS_26_2와 pECBHS_27_1에 존재하는 트랜스포존 Tn4401a에서는 플라스미드 pKPBHS_25_2과 비교하여 일부 결손이 발견되었으며, 이는 두 개의 플라스미드가 CPKp1825가 가지고 있는 플라스미드 pKPBHS_25_2로부터 수평 전달되었음을 제시한다. 위 연구결과들은 우리나라에 심각한 수준의 항생제 내성을 가지는 균주들이 빠르게 출현하고 있다는 것을 보여 준다. 특히, 본 연구에서 확인되거나 증명된 것과 같이 종이 다른 세균 사이에 접합이나 트랜스포존에 의하여 수평전달이 가능한 플라스미드 상에 blaKPC-2 유전자가 존재한다는 것은 이들에 대한 국가 수준에서의 억제 방법 및 지침서의 개발이 시급히 필요하다는 것을 제시한다.