Molecular analysis and enzymatic characterization of cathepsin B from olive flounder(Paralichthys olivaceus)

Abstract

Papain family중 하나인 cysteine protease는 근골격계 질환 치료를 위한target molecule로 인식 되어 왔으며 Cathepsin B 는 단백질 분해의 초기과정에 관여하는 cysteine proteases 중 하나이다. 본 연구는 넙치의 cathepsin B 유전자의 발현 양상과 넙치 cathepsin B(PoCtB)의 클로닝, 발현 및 효소특성을 분석하였다. cDNA Library Screeningdmf 이용하여 넙치의 cDNA를 클로닝하였다. 넙치의 동정된 cathepsin B 유전자는 1749bp의 open reading frame과 330개의 아미노산으로 이루어져있다. Cathepsin B의 propeptide region 내에 GNFD motif와 Occlucing loop 가 존재함으로써 이것이 명백하게 cathepsin B group이라는 것을 보여주며, 계통 유전학적 분석 결과 다른 종의 cathepsin B에 비해 초창기에 분화되어 나온 것으로 사료된다. RT-PCR을 수행한 결과 넙치의 모든 조직에서 cathepsin B가 발현되는 것을 볼 수 있었다. mature enzyme인 maPoCtB은 fusion protein인 glutathione S-transferase를 포함하는 pGEX-4T-1 vector에 삽입하여 E.coli 균주인 DH5α 내에 발현시켰다. 재조합 단백질인 PoCtB을 과발현 시킨 결과 53KDa의 분자량을 가진다. 넙치 cathepsin B 활성은 Z-Arg-Arg-AMC와 같은 fluorogenic 펩타이드 기질을 이용하여 측정되었고 적정 pH는 pH.7.5 이다.