Generation and characterization of chimeric rhabdoviruses expressing heterologous glycoproteins and Development of rapid neutralization assay using chimeric rhabdovirus

Abstract

Rhabdovirus는 enveloped, non-segmented, negative single-stranded RNA virus로 어류에 감염되는 rhabdovirus로는 infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV), viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), snakehead rhabdovirus (SHRV), hirame rhabdovirus (HIRRV), spring viremia of carp virus (SVCV)가 있다. 이와 같은 어류 rhabdovirus는 수온이 질병의 발생에 중요한 역할을 하는 것이 특징으로, IHNV, VHSV, HIRRV, SVCV는 주로 20°C 이하의 낮은 온도에서 질병을 일으키는 반면 SHRV는 28°C에서 31°C의 높은 수온에서 질병이 발생한다. 현재까지 각각의 rhabdovirus가 가지는 증식 온도나 병독성과 같은 특성들을 결정하는데 관여하는 여러 요소들에 대해 몇몇의 연구들이 이루어져 있지만 뚜렷하게 밝혀지지 않았으며 바이러스의 종류나 strain에 따라 상반된 결과들이 보고되어 있다. 따라서 본 연구에서는 rhabdovirus를 구성하는 단백질 중 바이러스의 막 밖으로 노출되어 있어 숙주 세포에 부착, 융합함으로써 바이러스의 감염과 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 glycoprotein (G)이 특정 온도에서 감염과 증식 그리고 병독성을 결정하는지 알아보기 위해, reverse genetics를 이용하여 다른 rhabdovirus의 G protein을 발현하는 chimeric rhabdoviruses (rSHRV-Gvhsv, rSHRV-Gsvcv, rVHSV-Gshrv, rVHSV-Gsvcv)를 제작하였다. 이를 이용하여 in vitro에서는 Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell에서 온도에 따른 plaque의 형성과 증식 능력을, in vivo에서는 zebrafish에서 병독성의 변화를 확인하고자 하였다. 그 결과, EPC cell에서 rSHRV-Gvhsv의 경우 plaque의 형성과 증식이 15°C와 20°C에서 한정되어 나타난 것을 볼 수 있었고, rVHSV-Gshrv와 rVHSV-Gsvcv는 20°C에서 가장 높은 증식 능력을 보였지만 기존의 증식 온도의 범위는 달라지지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 VHSV의 G protein은 VHSV가 낮은 온도에서 증식하는 특징을 결정하는데 관여하는 것으로 생각되지만, VHSV의 G protein을 높은 온도에서 잘 증식하는 바이러스인 SHRV와 SVCV로 바꾸어 주었을 경우 증식 온도의 범위가 변하지 않는 것으로 보아 VHSV의 증식 온도를 결정하는데 관여하는 요소는 G protein 이외에도 더 있을 것으로 보인다. 따라서 VHSV에서 G protein 이외의 단백질 중 낮은 온도에서의 증식을 결정하는데 관여하는 단백질이 있는지 알아보기 위해, 넓은 온도 범위에서 작동할 수 있는 SHRV의 minigenome을 제작하여 VHSV의 nucleoprotein (N), phosphoprotein (P) 그리고 RNA-dependent RNA polymerase (L) gene을 포함하는 helper plasmids와 함께 EPC cell에 transfection 하였고, SHRV의 helper plasmids를 공급해 주었을 때와 달리 15°C와 20°C에서만 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 더 나아가, SHRV와 VHSV의 helper plasmids를 heterologous한 조합으로 공급해 주었을 경우 VHSV N과 P를 각각 공급해 주었을 때 25°C와 28°C에서 minigenome이 작동한 것으로 보아 N protein과 P protein은 낮은 온도의 증식에 직접적으로 관련이 없는 것으로 생각되어 L protein이 VHSV의 온도 결정에 관여할 가능성이 가장 높음을 확인하였다. Zebrafish 감염 실험에서는 rVHSV-Gshrv와 rVHSV-Gsvcv가 감염성을 보이지 않았으며 rSHRV-Gvhsv는 높은 병독성을 획득하였다. 그리고 SVCV가 100%의 병독성을 나타낸 것과 다르게 rSHRV-Gsvcv는 폐사가 일어나지 않은 것을 볼 수 있었다. 따라서, SHRV와 SVCV는 G protein 보다는 다른 단백질이나 요소들이 병독성의 결정에 관여하는 것으로 보여지며, VHSV의 경우 G protein이 낮은 온도에서 감염성과 병독성을 결정하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 더 나아가, rhabdovirus의 G protein이 중화 항체의 형성을 유도할 뿐만 아니라 중화 항체에 대해 인식되는 주요 단백질이라는 점을 이용하여, 제작한 chimeric rhabdoviruses 중 VHSV 보다 증식 속도가 빠른 rSHRV-Gvhsv를 기반으로 하는 VHSV에 대한 중화 항체 시험법을 개발하고자 하였다. rSHRV-Gvhsv의 사용 가능성을 평가하기 위해 토끼에서 생산한 VHSV에 대한 면역혈청을 이용하여 western blot analysis 결과, VHSV에 대한 항체가 rSHRV-Gvhsv의 G protein과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 더불어 중화 반응을 가시적으로 확인할 수 있을 뿐만 아니라 많은 개수의 시료를 한 번에 스크리닝 할 수 있도록 chimeric rhabdovirus의 nucleoprotein gene (N gene)과 phosphoprotein gene (P gene) 사이에 enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene을 삽입하여 녹색 형광 단백질을 발현하는 chimeric rhabdovirus인 rSHRV-Gvhsv-eGFP를 제작하였고, 이를 이용해 토끼와 넙치 (Paralichthys olivaceus)의 면역혈청으로 중화 반응을 관찰할 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 rSHRV-Gvhsv-eGFP와 rVHSV-eGFP에 대해 중화 반응을 나타내는 성체 넙치의 혈청을 이용해 HIRRV에 대한 중화 항체 시험법을 실시하였으며, HIRRV에 대해 중화 반응이 나타나지 않는 것을 통해 VHSV의 항체에 대한 chimeric rhabdovirus의 특이성을 증명하였다. 본 연구에서 개발한 rSHRV-Gvhsv-eGFP를 이용한 VHSV의 중화 항체 시험법은 기존의 중화 항체 시험법보다 빠르고, 추가적인 과정 없이 현미경 관찰을 통해 보이는 형광의 정도로 혈청 내의 중화 항체 유무를 판단할 수 있어 편리하고, VHSV에 대한 중화 항체에 대해 특이성을 가지기 때문에 VHSV의 신속 중화 항체 시험법으로서 사용될 수 있을 것으로 여겨진다.