Isolation and Quantitative Cell Count of Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae using MPN-PCR Method

Abstract

수산물 중에서도 특히 어패류의 섭취 및 유통에 있어서, 식중독, 패혈증, 감염병 등을 유발하는 Vibrio spp.는 중점적으로 관리해야하는 미생물학적 위해요소 중 하나이다. 때문에 수산 식품에서 비브리오 속을 제어할 목적으로 다양한 분리 또는 정량 기법들이 개발되어 있다. 그러나 대부분의 기법들이 정량 검출과 균주의 분리 중 한 가지에만 초점이 맞춰져 있거나, 배양적인 방법을 통해 두 가지를 동시에 수행한다. 뿐만 아니라 고전적인 방법에서 주로 사용되는 선택-분리 배지인 TCBS agar의 경우 일부 Vibrio vulnificus가 Vibrio cholerae와 동일한 색상의 집락을 형성하는 문제점이 있다. 뿐만 아니라, 해양환경에 흔히 존재하는 Vibrio alginolyticus 역시 V. cholerae와 동일한 색상의 집락을 형성하여, 수산식품에서 V. cholerae를 검출해내는 과정에서 해당 집락의 V. cholerae 진위여부를 가리기 위한 추가적인 실험이 다량 요구될 수 있다. 이에, 본 연구에서는 기존에 개발된 정량 기법인 MPN-PCR법에 배양적인 방법을 접목하여, MPN-PCR 과정에서 필요한 PCR 소요를 최소화하고, 예방 모델 및 균주 특성 연구 등에 사용하기 위한 환경 중의 병원성 Vibrio spp. 균주의 분리를 동시에 수행가능하게 하고자 하였다. 이를 위하여, 기존의 MPN-PCR법의 APW를 이용한 증균 과정과 PCR 과정 사이에 TCBS와 같은 선택-분리 배지를 이용한 배양 과정을 추가하였으며, 동시에 해당 선택-분리 배지를 보조할 목적으로 NaCl이 제거된 Luria-Bertani agar배지(LB-0 agar, modificated Luria-Bertani agar)를 조제 및 이용함으로써, V. cholerae의 선택적 배양이 가능하도록 하였다. 여기에 사용된 LB-0 agar의 경우 기탁 기관으로부터 제공받은 표준균주와 본 연구진이 분리한 균주를 포함한 13개의 V. vulnificus, V. cholerae 및 V. alginolyticus 균주를 이용하여 V. choleerae에 대한 선택적 배양 능력을 검증하였다. MPN-PCR 법의 V. vulnificus 및 V. cholerae에 대한 정량 분석 능력 검증을 위해서, 생굴 (Crassostrea gigas)에 V. vulnificus 및 V. cholerae를 인위적으로 생물 농축시켜 사용하였다. 이는 이매패류가 주변 환경의 세균 및 바이러스 등을 생물 농축 과정을 통해 축적하는 특성을 고려한 것으로, Martins 등(2006)이 Escherichia coli를 이용해 수행한 연구에서 시사한 것처럼 실제 환경 조건에 가장 가까운 시료로써 매우 효과적이라 볼 수 있다. 앞선 분리 및 정량 과정 이후에는 콜레라 혈청형 (O1 및 O139) 판별 및 병원성 관련 인자 보유 여부를 확인하기 위한 PCR 과정이 이어지도록 설계하였는데, 목적 검출 병원성 관련 유전자는 V. vulnificus의 경우 vvh, viuB 및 vcgC 유전자를, V. cholerae의 경우 ctxA, tcpI 및 zot 유전자를 선택하였다. 뿐만 아니라 V. cholerae의 tcpI와 zot에 대한 특이 프라이머를 Primer-BLAST®을 이용하여 새롭게 디자인함으로써, 기존에 다른 연구들에서 제시된 특이 프라이머에 비해 정확성을 향상하였다. 이러한 일련의 과정들을 통하여 개선된 MPN-PCR법은 2019년 2월부터 동년 10월까지 9개월간 우리나라 인근해역에서 채취된 해수 및 유통 수산물 시료의 분석에 이용함으로써, 실제 V. vulnificus 및 V. cholerae의 동시 분리 및 정량에 이용할 수 있음을 확인하였다. 이는 결과적으로 본 연구에서 기존에 사용되던 분자생물학적 기법 대비 저비용화되고, 배양적 기법 대비 결과의 신뢰성이 향상된 분리 및 정량 동시 분석법을 개발하였음을 의미한다.