Molecular studies on fish biodiversity with environmental DNA (eDNA) in Korean waters

Abstract

어류 생물다양성의 효율적인 모니터링 및 관리는 필수 요소 중 하나이며, 인위적 또는 자연적 원인으로 다양한 환경 사건을 이해하기 위한 기본 정보를 제공한다. 어류 생물다양성 분석을 위한 전통적인 모니터링 방법은 주로 형태 학적 식별에 의존하지만, 이는 높은 관찰 시간, 노동 및 비용을 필요로 한다. 환경 DNA (eDNA) 메타바코딩은 종 식별 또는 그들의 풍부도의 추정을 위한 전통적인 방법의 대안적인 전략으로 적용되고 있으며, 이는 비교적 저렴한 비용과 노력으로 신뢰할 수 있는 결과를 생성 할 수 있다. 그러나 비교적 최근 생태 조사에 도입되어 표준 파이프라인이 아직 확립되지 않았으며 직접 사용하기 전에 몇 가지 문제를 해결해야한다. 여기서는 MiFish 파이프라인을 사용하여 해수 시료 내의 어류의 생물다양성을 분석하기 위해 eDNA 메타바코딩 방법을 채택하였다. 한국의 가막만에서 수집한 연중 물 샘플에서 총 128 종이 검출되었다. Engraulis japonicus는 가막만에서 가장 풍부하게 발견되었으며 Mugil cephalus, Nuchequula nuchalis 및 Acentrogobius pflaumii가 그 뒤를 이었다. 각 물 샘플에서 어류 군집의 유사도 분석은 계절적 변화는 있었지만 공간적 특성은 약했다. 어류 생물다양성 분석을 위한 eDNA 메타바코딩의 신뢰성은 이각망, 저층 트롤 및 자망을 포함한 다른 채집 장비를 사용한 3 개의 기존의 전통적인 조사와 비교하여 eDNA 메타바코딩 분석에서 더 높은 종 수가 표시되어 증명되었다. Illumina의 MiSeq 플랫폼을 사용하는 MiFish 파이프라인은 적은 수의 지역 (국내) 바코드 데이터베이스, 분류 범위 그리고 볼락류, 가자미류 또는 복어류를 포함한 여러 분류군을 구분할 수 없는 작은 앰플리콘 크기 (~ 170 bp)와 같은 몇 가지 한계를 극복 할 수 있다면 어류 생물다양성 분석에 유용한 도구가 될 것이다. 논문의 두 번째 부분에서는 어류 관련 범용 프라이머 세트인 RiboFish를 개발했으며 MiFish 프라이머 세트와 비교할 수 있었다. RiboFish는 2016 년 1월부터 6월까지 동해의 중북부 연안에서 채집된 동물플랑크톤 샘플로 테스트되었다. RiboFish 프라이머의 신뢰성은 이전 연구에서 사용한 프라이머인 MiFish 및 ecoPrimer와 비교하여 입증되었다. 새로 개발된 어류 특이적 RiboFish 프라이머는 MiFish 프라이머에서 밝혀진 관련 종 차별의 한계를 극복 할 수 있었다. RiboFish는 생물정보학 공정에서 수율이 비교적 낮지만 정확한 종 식별과 교차 반응성이 없었다. RiboFish를 사용한 메타바코딩 분석 최적화는 어류 다양성 분석을 위한 강력한 프라이머가 될 수 있다.

Efficient monitoring and management of fish biodiversity is one of the essential factors, which provides the fundamental information to understand the various environmental events by either anthropogenic or natural causes. Although the traditional monitoring methods for the fish biodiversity analysis have been mainly dependent on the morphological identification, which requires a high degree of observation times, labors, and costs. Environmental DNA (eDNA) metabarcoding is being applied as an alternative strategy of the traditional methods for the species identification or its abundance estimation, which can produce a reliable result with relatively low cost and efforts. However, its standard pipeline is still not established due to its recent introduction in ecological survey and several issues should be cleared before its direct use. We here adopted eDNA metabarcoding method to analyze fish biodiversity from the water sample using MiFish pipeline. Total 128 species were detected from a year-round water samples collected from the Gamak Bay, Korea. Engraulis japonicus was most abundantly identified in the Gamak Bay, followed by Mugil cephalus, Nuchequula nuchalis, and Acentrogobius pflaumii. Similarity analysis of fish assemblage in each water sample showed their seasonal changes but weak regional characteristics. Higher species numbers were shown in eDNA metabarcoding analysis compared with three previous traditional surveys with different fishing gears including the fyke net, the trawl, and the gill net indicating the reliability of eDNA metabarcoding for the fish biodiversity analysis. Collectively, MiFish pipeline using the Illumina MiSeq platform would be the useful tool for the fish biodiversity analysis as long as several limitations can be overcome such as low numbers of regional (domestic) barcode database, taxon-coverage, or small amplicon size (~170 bp) to discriminate several taxa including rockfish, flatfish, or puff fish taxa. In the second part of the dissertation, we developed the RiboFish, a piscine-specific universal primer set, which is comparable to MiFish primer set. RiboFish was tested with the plankton net samples collected from the coastal waters of East/Japan Sea between January and June in 2016. The reliability of RiboFish primers was demonstrated by comparing with MiFish and ecoPrimer which primers employed in previous studies. Newly developed fish specific RiboFish primers can overcome the limitations of related species discrimination revealed in MiFish primer. Although RiboFish has a relatively low yield in the bioinformatics process, it has accurate species identification and no cross reactivity. The optimization of metabarcoding analysis using RiboFish might be a powerful primer for analyzing fish diversity.