피부 손상 치료제로의 응용을 위한 상피세포 성장인자와 콜라겐 부착 단백질 융합체 개발

Abstract

사람의 성장인자(growth factor)들 중에서 53개의 아미노산으로 이루어진 상피세포 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF)는 상피세포의 재생 및 생장촉진, 상피세포내의 keratinosyte 세포의 이동, 육아세포(granulation tissue)의 형성 촉진, 그리고 섬유아세포(fibroblast) 세포의 운동성의 증진 등의 다양한 활성을 나타내기 때문에 상처치유 과정에서 매우 중요한 물질이며, 이러한 다기능성 활성 때문에 의학 및 화장품 산업에서 매우 유용한 도구로 각광받고 있다. 그러나 hEGF는 체내에서의 낮은 생산량, 혈류로의 확산으로 인한 낮은 농도로의 존재, 한정된 표적 특이성, 그리고 짧은 반감기 때문에 치료제로써의 활용이 제한되어 왔다. 본 연구에서는 이러한 hEGF의 단점을 보완하기 위하여 Vibrio mimicus의 metalloprotease에서 분리한 collagen-bindin domain (CBD)이 융합된 재조합 단백질을 만들었다. 기존의 연구에서는 33개의 아미노산으로 이루어진 융합단백질을 개발하였으나 더욱 크기가 줄어든 18개와 12개의 아미노산으로 이루어진 CBD moiety를 EGF의 C-말단과 N-말단에 각각 부착하였다. 이러한 fusion protein들은 pET vector system을 이용하여 대장균에서 insoluble inclusion body의 형태로 발현되었으며, urea를 이용한 변성 후 투석방법과 Ni-NTA column을 이용하여 각각 순수하게 정제하였다. 네 개의 fusion 단백질은 hEGF를 부착한 상태에서도 높은 collagn-binding 활성을 나타내었으며, A-431과 HaCaT 세포주를 이용한 실험 결과 대조구 보다 높고 EGF와 비슷한 세포 증식 활성을 보였다. 이러한 binding 활성과 세포증식 촉진효과는 본 연구에서 개발한 fusion protein들이 상피세포 치료제로써의 높은 활용 가능성을 의미한다.

Among the human growth factors, epidermal growth factor (hEGF) consisting of 53 amino acids exhibits various effects on epidermal cell regeneration, stimulation of proliferation and migration of keratinocytes, promote formation of granulation tissues, and stimulates fibroblast motility, which are important in the process of wound healing. For these multifunctional activities, EGF is employed as useful implement for pharmaceutical and cosmetics agents. But, low productivity, limited target specificity and short-half life inhibits the application of EGF as therapeutic instrument. To overcome these obstacles, we have constructed collagen-binding domain (CBD) of Vibrio mimicus metalloprotease fused chimeric EGF proteins. 18 and 12 amino acids portions of 33 amino acids, which was essential for collagen binding activity, were combined with N-terminus and C-terminus of EGF. We have constructed EGF(52aa)-CBD(18aa), EGF(53aa)-CBD(12aa), CBD(18aa)-EGF(53aa) and CBD(12aa)-EGF(53aa), and expressed, produced and purified using pET-22b vector, Escherichia coli BL21(DE3) expression system and Ni-NTA column chromatography, respectively. Purified four recombinant proteins revealed enhanced A-431 and HaCaT cell numbers than non-treated specimen and similar numbers of control hEGF. The collagen-binding activities with type I collagen were also observed. Furthermore, CBD hybridized hEGF amplified phosphorylation signals of EGF receptor. These results suggest that fusion proteins may be able to recommend as a therapeutic agent in wound tissue healing.