Characterization of petidyl-prolyl cis/trans isomerase (FklB) of Vibrio anguillarum and expression pattern under stress conditions

Abstract

생체 내에서 molecular chaperone protein은 각종 외부 환경의 변화에도 생물이 항상성을 유지하여 생육할 수 있도록 발현되는 단백질의 3차구조 형성에 관여하여 기능을 잃지 않도록 하는 중요한 역할을 한다. 이러한 단백질 중 하나인 peptidyl prolyl cis-trans isomerase 역시 proline의 구조를 cis→trans 로 바꾸어 단백질이 정상적인 구조를 형성할 수 있게 하거나, 환경변화 등으로 인한 단백질의 aggregation을 방지하는 기능을 한다. 현재까지 eukaryotes이나 E. coli의 PPIase에 대한 연구는 종종 보고가 되고 있지만 Vibrio anguillarum 유래의 PPIase에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않은 상황에서, 이러한 molecular chaperone protein이 pathogenic bacteria의 virulence factor와도 밀접한 연관을 가진다고 알려지는 가운데 어패류의 vibriosis를 유발 하여 양식 산업의 경제에 큰 영향을 미치는 V. anguillarum의 PPIase에 대한 연구는 그 가치가 크다. 본 연구에서는 V. anguillarum에 존재하는 PPIase 가운데 protein level에서 저온(15℃)과 알칼리(pH10) 환경에 노출되었을 때 과발현 된 PPIase에 대한 연구를 수행하였다. Stress 환경에 노출되었을 때 gene level에서의 과발현과 V. anguillarum 내에서 PPIase의 localization을 통해 periplasmic protein임을 확인하였다. PPIase가 가지는 활성을 확인하는 citrate synthase thermal aggregation assay와 protease coupled assay를 통하여 단백질의 aggregation을 방지해주는 기능과, peptide 내의 proline 잔기의 구조를 isomerization 시키는 기능을 가진다는 사실을 밝혔다. Isomerization activity는 5℃와 pH 6의 condition에서 가장 높은 활성을 보였으나, 5-20℃, pH5-10의 condition에서도 활성을 보였다. 이는 다른 조건에서도 활성을 가지지만 PPIase가 과발현 된 조건인 저온 환경과 알칼리에 V. anguillarum이 노출되었을 때, periplasm에서 다른 단백질의 구조형성에 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

Vibrio anguillarum, a gram negative bacteria and causal agent of vibriosis in fish and shellfish, ultimately affects the economy of aquaculture industry. Molecular chaperones play an important role in the folding of protein structures to maintain their functions in changed environmental conditions. Petidyl-prolyl cis/trans isomerases (PPIases) as chaperone catalyze the cis-trans isomerization of peptide bonds of proline residues to form functional structure or prevent protein aggregation during stress conditions. PPIases are reported to involve in virulence for bacteria. In this study, PPIase from V. anguillarum O1 was induced at low temperature (15℃) and high alkaline condition (pH 10) and then characterized by observing the expression in gene level using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The PPIase gene was cloned and recombinant protein was purified by affinity chromatography to check the function of PPIase and production of antibody. Citrate synthase thermal aggregation assay was performed to find out the inhibition of aggregation, and protease coupled assay was performed to find out the isomerization of proline conformation after determination of the optimum temperature and pH of this protein. The highest activity was found at 5℃ and at pH 6. We performed fractionation of V. anguillarum O1 and western blot to check the location of PPIase in V. anguilllarum O1. In can be concluded that PPIase located in periplasm of V. anguillarum O1 may play a key role in the survival of this bacteria at low temperature and high alkali.