Development of PCR system targeting groEL gene as a useful phylogenetic marker for detection of human pathogenic Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus

Abstract

수산생물 및 해양 환경에 존재하는 병원성 Vibrio 균은 인체 및 양식 수산물에 심각한 질병을 유발하며 심지어 사망에까지 이르게 하는 치명적인 균이다. 특히, Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) 및 V. vulnificus (Vv)는 대표적인 병원성 Vibrio 균주로 잘 알려져 있으며, 이들은 막대한 개인적, 경제적, 사회적 손실을 야기한다. Vc는 콜레라를 유발하는 병원균으로서 감염시 심각한 탈수 증세를 동반한 설사를 일으킨다. 콜레라의 경우 전염성이 매우 뛰어나므로 개발도상국과 같은 나라에서 특히 위험한 균주로 여겨지고 있다. Vp는 일반적으로 Vp가 오염된 어패류의 섭취를 통해 감염되며 장염을 일으키는 대표적인 장염 비브리오 균이다. 또한 Vv는 비브리오 패혈증 균으로서 상처감염증 (wound infection) 또는 원발성 패혈증(primary septicemia)를 유발시키며 설사, 통증과 함께 다양한 피부 염증이 발생하는 감염성 질환을 일으킨다. 국내에서는 매년 20-40명의 환자가 발생하며 치사율이 50% 이상에 이르게 하는 병원성 균이다. 특히 접근성이 높은 어류 및 새우 등을 포함한 해양생물의 경우 물 속 미생물을 걸러서 먹이를 섭취하는 여과 섭식자(Filter feeders)로서, 이러한 기능이 사람에게 병원성 비브리오를 옮기는 중요한 수단으로 작용한다. 또한 최근 해산물이 미래의 식량자원으로서 각광받음에 따라 이들의 소비가 증가하고 있고, 특히 한국, 일본 및 중국의 경우 해산물을 날것으로 섭취하는 경우가 많으므로 Vibrio 감염에 대한 주의가 더욱 요구되는 실정이다. 한편, 미생물의 유전자 수준에서의 판별을 위하여 16S rRNA 및 다양한 병원성 유전자 (ctx, vvh, toxR, hly, omp, trh, tdh) 등을 이용한 primer set가 고안되어 있지만, 16S rRNA는 종간에서도 매우 높은 상동성을 나타내므로 종간의 판별이 매우 어렵다는 단점이 있으며 병원성 유전자는 비병원성 미생물은 검출되지 않으며 목적 유전자 이외의 또다른 병원성 인자를 가지는 병원성 미생물은 검출되지 않을 수 있다는 단점이 있다. 따라서 이를 보완하기 위한 마커 유전자로서 house keeping gene이 사용되고 있으며, 최근 다양한 미생물의 검출을 위하여 groEL 유전자가 적절한 마커 유전자로 인식되고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는, groEL 유전자를 이용하여 위험균으로 인식되고 있는 Vc, Vp 및 Vv를 PCR, duplex PCR 및 multiplex PCR을 이용하여 쉽고 빠르게 검출하는 방법을 개발하고자 하였으며, 본 연구를 통하여 실제 수산물에 감염된 인체 유해 병원성 Vibrio 균의 존재를 쉽고 정확하게 진단하여 안전한 수산물의 유통 및 양식장 어패류의 Vibrio성 대량 폐사를 예방하고자 하였다. 첫째, PCR method를 이용하여 Vp를 검출하기 위하여 Vp의 groEL 유전자에 특이적인 primer를 제작하였으며, 환경으로부터 스크리닝 한 Vp를 포함한 70개의 Vp sample로부터 510bp의 뚜렷한 PCR 증폭산물을 확인 할 수 있었다. 특히, 본 연구에서 제작된 primer의 annealing 온도는 68°C 이상으로서 좀더 빠르고 특이적인 검출을 하는데 용이하였다. Vp groEL primer는 chromosomal DNA 와 감염 조직으로부터 분리한 DNA를 각각 100pg, 1ng까지 검출할 수 있었다. 둘째, Vp를 strain 수준에서 구분하고 검출하기 위하여 특이적인 마커로서 groEL(510bp) 및 두 병원성 마커인 tdh(382bp)와 trh(171bp)를 사용하여 multiplex PCR assay를 구축하였다. 최적화된 multiplex PCR 조건의 민감도 및 효율성을 확인하기 위하여 Vp가 감염된 조개 및 해수를 이용하였으며, 모든 sample에서 효과적으로 검출 및 strain 구분이 가능하였다. 세가지 primer set를 이용한 multiplex 방법의 검출 한계는 200pg이었다. 셋째, PCR을 이용하여 Vc와 Vv를 동시에 검출하는 duplex PCR 방법을 구축하고자 각각의 Vibrio에 특이적인 groEL primer를 제작하였으며, 제작된 primer를 이용하여 primer의 특이성 및 민감도를 확인하였다. Vc(418bp)와 Vv(192bp)는 유연관계가 가까운 Vibrio 종 사이에서도 특이적으로 검출 가능하였으며, 100pg의 chromosomal DNA까지 검출 가능하였다. 또한 실제 sample에 적용 가능 여부를 확인하기 위하여 조개, 넙치 및 해수를 이용하여 실험한 결과 효율적으로 Vc와 Vv를 동시에 검출할 수 있었다. 넷째, 인체 병원성 Vibrio인 Vc(418bp), Vp(644bp) 및 Vv(192bp)를 동시에 검출하기 위한 multiplex PCR assay를 구축하기 위하여 각각의 groEL 유전자에 species-specific한 primer set를 제작하였다. Primer의 특이성과 민감도를 확인하기 위하여 총 131 종의 Vibrio와 non-Vibrio strain을 사용하였으며, 각각의 목적하는 strain을 특이적으로 검출할 수 있었다. Multiplex PCR의 검출 한계는 100pg의 DNA였으며, 세 Vibrio 종이 감염된 조개, 넙치 및 해수 sample에서도 특이적이고 정확한 검출이 가능하였다. 본 연구에서는 병원성 Vibrio 종을 simplex 특이적으로 검출하기 위한 마커로서 groEL 유전자를 이용하였으며, Vc, Vp 그리고 Vv를 PCR, duplex PCR 및 multiplex PCR을 이용하여 검출하기 위한 확실하고 적합한 마커임을 확인하였다.

Vibrio species are naturally diverse bacteria that inhabit aquatic environments and marine animals as symbionts and commensals. Among the identified Vibrio species, Vibrio cholerae (Vc), V. parahaemolyticus (Vp) and V. vulnificus (Vv) are of major concern as they are pathogenic to animals including humans. Vibrio infections remain a serious threat to public health. In the last decade, Vibrio disease outbreaks have created a painful awareness of the personal, economic, societal, and public health costs associated with the impact of contaminated water and seafood in the aquatic environment. Vc is the etiological agent of cholera, an acute dehydrating diarrhoea that occurs in epidemic form throughout the world, particularly in developing countries. Vp is a leading pathogen that causes seafood-borne gastroenteritis worldwide. Another pathogen, Vv, causes gastroenteritis, septicaemia and severe wound infection with a high mortality in susceptible persons. Moreover, both Vp and Vv strains can cause diseases in aquatic organisms, including economically important fish and shrimp. Filter feeders act as carrier in transferring these pathogens. Accurate detection is necessary before drinking water, consumption of raw seafood or during outbreak of any disease produced by these species. In this study, the efficiency of groEL gene, which has proven as a good marker in detection of pathogens, was checked for the detection of above mentioned Vibrio species accurately by PCR assays. Genomic DNA was purified from pure cultures of 22 Vibrio and 10 non-Vibrio enteric species. All available sequences of groEL gene among Vibrio and non-Vibrio enteric species were accepted from GenBank using the BLASTN search program. Potential oligonucleotide primer sets were designed to detect Vc, Vp and Vv by simplex, duplex or multiplex PCR. After optimizing PCR conditions, the specificity and sensitivity test of PCR assays were performed. Shellfish homogenates, flounder and sterilized seawater were artificially inoculated with the target Vibrio species to check the efficiency of developed PCR methods. First target was to detect Vp specifically and for that PCR conditions were standardized and tested to evaluate the specificity of primers. A 510 bp band was appeared only from Vp by PCR. Notably, the detection was shown to be functional at high annealing temp above 68°C. The groEL primers detected 100 pg and 1 ng of DNA purified from Vp culture and artificially infected oyster tissue, respectively. Second target was to develop a multiplex PCR assay for detection and differentiation of Vp strains using primer sets; a species-specific marker, groEL, and two virulence markers, tdh and trh. After standardization of multiplex PCR, the sensitivity and efficacy of this method was validated using artificially inoculated shellfish and seawater. The expected sizes of amplicons were 510 bp, 382 bp, and 171 bp for groEL, tdh, and trh, respectively. PCR products were sufficiently different in size, and the detection limits of the multiplex PCR for groEL, tdh and trh were each 200-pg DNA. Specific detection and differentiation of virulent from non-virulent strains in shellfish homogenates and seawater was also possible after artificial inoculation with various Vp strains. Third target was to develop a duplex PCR assay using two sets of primers targeting the groEL gene for the accurate simultaneous detection of Vc and Vv. The primer sets were found to be specific for these two species and could detect both target bacteria without any ambiguity, even among closely related species. For both species, the detection limit was 100 pg from purified genomic DNA. The duplex PCR showed high specificity and sensitivity for each species and was sufficient for the detection of Vc and Vv from artificially infected shellfish tissue, flounder, and even inoculated seawater. Final target was to develop an effective multiplex PCR assay for the simultaneous detection of three important Vibrio species, Vc, Vp and Vv using the groEL gene. Three species-specific primer sets were designed to target Vc, Vp and Vv. A total of 131 Vibrio and non-Vibrio strains were used to determine the specificity and sensitivity of primers. The primers produced specific PCR fragments from all target species strains and did not cross react with other Vibrio and non-Vibrio species. This PCR method showed good efficiency in detecting co-existing target species in the same sample with a detection limit of 100 pg of Vc, Vp and Vv from mixed purified DNA. Detection of three target species was also possible from artificially inoculated shellfish, flounder and seawater. We found that this groEL gene is a good marker for the specific detection of Vibrio species. All the results suggest that groEL gene-targeted PCR assay may be suitable and reliable method for the species-specific detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus from clinical and environmental samples.