Enhancement of soluble recombinant proteins expressed in E.coli using the modified OmpA signal peptides

Abstract

대장균은 쉬운 조작, 짧은 세대, 경제성 및 대량증식이 가능하기 때문에 가장 많이 사용되는 원핵생물 숙주이다. 그러나 대장균에서 진핵 유전자의 발현 시 요구되는 수용성 발현에 대해서는 재조합 단백질의 전체 아미노산 서열의 내부적 물리적인 특성인 전위 (pI), 소수성 (hydrophobicity), 안정성 (stability), 및 분자량에 의해 수용성 발현이 결정된다고 추측되고 있으나 명확한 근거는 없는 실정이다. 이런 문제점을 극복하기 위해 우리는 대장균의 신호서열 중 하나인 OmpA 신호서열 단편을 목적단백질의 N-말단에 부착시켜 폴딩되지 않는 홍합유래 접착성 단백질 Mefp1의 수용성 발현을 조사하였다. 이 단백질은 기존의 재조합 발현 벡터를 이용하여 수용성 발현이 불가능함으로 우리는 이 Mefp1의 수용성 발현을 위해 OmpA 신호서열을 이용하였다. OmpA 신호서열 단편을 Mefp1의 N-말단에 부착시킨 결과 몇 몇 OmpA 신호서열 단편 (OmpA 신호서열에서 신호서열 펩티데이즈에서 절단되는 OmpA 신호서열 단편을 OmpA signal peptide[OmpASP]이라고 하고, 이 OmpASP에서 C-말단부터 절단하여 축소된 길이를 truncated OmpA signal peptide, OmpASPtr이라고 부름)을 제외하고는 대부분 OmpASPtr들은 대조구보다 수용성 발현을 증가시켰다. 특히 단편 길이 OmpASP3-21의 pI 값은 10.55로 동일하여 수용성 발현을 증가시키는 데 관여한 신호서열의 기능은 pI 값에 의한 signal directionality임을 밝혔다. 폴딩되는 넙치 헵시딘 I (olive flounder Hecidin I, ofHepI)을 수용성으로 발현을 위해 여러 가지 발현 벡터와 앞서 개발된 OmpASPtr를 선도서열로 사용하였으나 수용성으로 발현이 되지 않아, OmpASPtr과 ofHepI 사이에 여러 가지 아미노산을 삽입할 수 있는 형태의 벡터, OmpASPtr-(XXX= amino acids)-ofHepI를 구성하여 여러 아미노산을 스크리닝 한 결과 높은 친수성과 pI 값을 가진 polyArg 및 polyLys이 삽입되었을 때 높은 수용성 발현을 보였고, 또한 선도서열의 친수성 프로파일을 분석한 결과 삽입된 polyArg 및 polyLys가 막 투과 유사 구조 (transmembrane-like domain)를 가져 이를 분비증강자 서열이라고 명명하였다. 앞서 폴딩되지 않는 홍합유래 접착성 단백질 Mefp1 발현에는 OmpA 신호서열 단편 (OmpASPtr)들이 갖는 pI 값 10.55 만 선도서열로 수용성 발현을 조사하였으나, pI 값 10.55외에 수용성 발현에 대한 pI 값의 특성을 추가적으로 규명하기 위해, 짧은 선도서열의 pI 값을 pI 2.73에서 13.35까지 다양하게 디자인하여 Mefp1의 N-말단에 부착시켜 수용성 발현을 조사한 결과 산성 pI 2.73-3.25, 중성 pI 4.61-9.58 및 염기성 pI 9.90-13.35에 각각 해당하는 특이적인 수용성 발현 커브가 존재함을 밝혀, 수용성 발현에는 pI 값에 의한 특이적인 3 가지 수용성 분비 채널이 존재함을 입증하였다. 다음은 pI 값과 친수도가 폴딩되는 재조합 단백질 green fluorescent protein (GFP)의 수용성 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 OmpA 신호서열 단편에서 유래한 변이된 pI 값을 갖는 N-말단(Met-X-X)과 친수성 폴리펩티드 8 x Arg 사이에 OmpA 신호서열에서 유래한 앵커서열(OmpASP4-8)을 활용하여 pI 값과 친수도를 분리하여 GFP의 N-말단에 부착시켜 수용성 발현을 조사한 결과, 산성>중성의 순으로 수용성 발현이 이루어졌고, 염기성 N-말단에서는 수용성 발현이 저해되었다. 따라서 이러한 폴딩되지 않는 단백질(Mefp1)과 폴딩되는 단백질(GFP)의 수용성 발현 결과를 종합하여 우리는 대장균에서 페리플라즘으로 분비되는 type II 경로인 Tat, Yid 및 Sec 채널의 존재를 규명하였고, 특히 Met 뒤에 pI 값과 친수도를 동시에 갖는 아미노산을 연결할 경우, pI 값에 관계없이 친수도에 의해 폴딩된 단백질이 수용성으로 발현되며, 이러한 결과들은 지금까지 알려진 Tat 신호서열들의 기능을 효율적으로 대체할 수 있음을 입증하였다.

Escherichia coli has been the most widely used prokaryotic host because this bacterium can be easily manipulated, has a short generation time, is economical, and lends itself easily to scale up. However, when E.coli is used to express eukaryotic genes, the recombinant protein is removed or expressed inclusion bodies due to the production of many large, complex proteins containing disulfide bonds, or proteins that require post-translational modifications. To overcome these problems, we fused the C-terminal truncated Outer membrane protein A signal peptide (OmpASPtr) at N-terminal of marine mussel adhesive protein Mefp1. We found that a short segment of OmpASP enhanced the soluble rMefp1, and confirmed the coating ability of rMefp1. The short OmpASPtr peptides have pI values of 10.55. The mature form of olive flounder hepcidin I (HepI) is a 26-amino acid (aa) polypeptide, which has good homology with human hepcidin in the eight conserved cysteines forming four disulfide bonds. However, the gene for HepI was not expressed in a soluble form. We attempted to express recombinant HepI (rHepI) from an OmpASPtr

HepI construct, but this fusion protein was not expressed in a soluble form in E.coli. We constructed that inserted various amino acids into the (xxx) site of the OmpASPtr

(xxx)

Xa leader sequence. We found that soluble expression increased when one or more amino acid of high pI and hydrophilicity was inserted to act as an expression enhancer, and these constructs formed transmembrane (TM)-like domains that are larger than the internal TM-like positively charged domain of the target protein. We further investigated the effect of the pI (ranging from 2.73-13.35) of the N-terminal region of 7xMefp1 on soluble and insoluble expression. We found that three pI range curves (acidic, neutral, and alkaline) and each curve was derived from a different periplasmic translocation pathway, Tat, Yid, and Sec, respectively. Tat pathway has a strong co-relationship with the soluble expression of folded target proteins, but not those associated with Yid and Sec. To validate the proposed translocation pathways for the folded protein, we investigated the soluble expression of GFP with the established pI-range values of N-termini with acidic, neutral, and alkaline curves. We also examined the regular size and position of the secretion enhancer sequence for hydrophilicity. Our results showed that the pI value and hydrophilicity of the short N-terminal polypeptide and the total translational efficiency of target proteins are important factors for translocation through the Tat pathway.