Application of novel bioactive tetrapeptide derived from mackerel muscle hydrolysate and its analogues

Abstract

Fishery products, which are a source of high proteins, are frequently used as food, but fishery wastes (by-products) are generated in the process of being processed. The amount of fishery waste generated is increasing every year, but there are few ways of it in an environment-friendly treatment way. As an eco-friendly treatment method of fishery waste, many studies are being conducted to recycle it as fertilizer, feed, fuel, etc. This study tried to find a way to re-use mackerel waste liquid by bioengineering it. Globally, harmful algal blooms is having a negative impact on aquaculture and fisheries. Eco-friendly materials for harmful algal blooms treatment include microbial metabolites, proteins, enzymes, peptides, and lipids, and these biological substances are abundantly contained in fishery waste. In Chapter 1, algal efficacy substances of mackerel waste liquid biotechnologically treated cultured products were analyzed. By biodegradation of mackerel by-products, whey, and okara using microorganisms, algcidal activity according to protein degraded sources was compared. Selective algicidal activity on harmful algae was observed in the 48 hours - biodegraded mackerel by-product only. In order to identify algicidal substances, the algicidal activity was compared through organic solvent extraction and molecular weight cut off (primary) of a 48-hour biodegraded mackerel. After that, low molecular weight of below 2kDa exhibited the highest algicidal acitivity, and it was isolated (second and third) using size exclusion and reverse-phase liquid chromatography. Then, a novel tetrapeptide having a low molecular weight exhibited algicidal activity was identified using UPLC-ESI-MSMS. Among eco-friendly methods for controlling harmful algae, peptides have a very rapid effect and there is little secondary pollution. Additionally, in order to apply algicides to the field, study on the mechanism of action of algicidal substances is required. However, very little is known about the mechanism of algicidal peptides against harmful algae. In Chapter 2, biochemical (esterase, reactive oxygen species) and morphological changes of tetrapeptide treated harmful algae were observed to investigate the mechanism of death. Although other previously reported algicidal peptides exhibited simultaneous plasma membrane disruption and algicidal activity, the tetrapeptide penetrated algal cells and exhibited biochemical changes, which was confirmed by confocal microscopy using tetrapeptides coupled with fluorescent probes. In addition, it was confirmed by comparative analysis with tetrapeptide analogues that the tetrapeptide has a unique algicidal mechanism that is different from the existing algicidal peptides. Identified novel tetrapeptide as a superior antibiotics could has other useful bioactivity at the same time. Antibiotic peptides are already known to have anti-diabetes, anti-inflammatory, metabolic diseases enzyme inhibition, and anticancer in various studies, so they are being studied a lot as medicines and preparations for other purposes. In particular, antibiotic peptides have anticancer activity because their molecular dynamics of action is similar to that of anticancer peptides. In Chapter 3, to broad use on industrial application anticancer and metabolic enzyme inhibitory activity of tetrapeptide were analyzed. Tetrapeptide analogues were designed by insertion with useful scaffold peptides to increase the biochemical stability and anticancer activity. Hemolytic activity of tetrapeptide anaolgues were analyzed using an artificial neural network, the designed tetrapeptide analogues were calculated to have a hemolytic effect with a very low probability. Although anticancer activity probability of analogues was lower based on the computational sequence analysis, but actually showed excellent anticancer efficacy against HepG2 and AGS cancer cells. In addition, tetrapeptide analogues showed excellent resistance to trypsin. The tetrapeptide analogues were analyzed for various bioactivities included the inhibitory activity of antidiabetic (alpha-amylase) and metabolic enzymes (acetylcholinesterase). In addition, the tetrapeptides and analogues developed in this study are very short and low molecular weight, so they can lower the production cost and are economical. This study provided basic information on a novel tetrapeptide purification, identification method and a unique algicidal mechanism, and showed the potential to be used as an excellent antibiotic and anticancer agent.

고단백질원인 수산물은 식품으로 많이 애용하는데, 가공되는 과정에서 수산폐기물(부산물)이 생성된다. 수산폐기물 발생량은 매년 증가하고 있으나 이를 친환경적으로 처리하는 방법이 매우 부족한 상황이다. 수산폐기물을 친환경적인 처리방법으로 비료, 사료, 연료 등으로 재활용하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구는 고등어 폐액을 생물공학적으로 처리하여 재이용 방안을 모색하고자 하였다. 전 세계적으로 유해 조류 대번식이 수산물의 양식업 및 어업에 부정적인 영향을 미치고 있다. 유해 조류 제어를 위한 친환경 소재로는 미생물 대사산물, 단백질, 효소, 펩타이드, 지질 등이 있으며, 이러한 생물학적 물질은 수산폐기물에 풍부하게 함유되어 있습니다. Chapter 1에서는 고등어 폐액을 생물공학적으로 처리한 배양산물의 살조 효능 물질을 분석하였다. 고등어 부산물, 유청, 콩비지를 미생물을 이용한 생분해로 단백질 분해원에 따른 살조 활성을 비교하였다. 48시간 동안 생분해된 고등어 부산물에서만 유해조류에 대한 선택적 살조 활성이 관찰되었다. 살조 물질을 동정하기 위하여 48시간 생분해된 고등어의 유기용매 추출과 분자량 컷오프(1차)를 통해 살조제 활성을 비교하였다. 그 후, 2k Da 미만의 저분자 물질이 가장 높은 살조 활성을 나타내었고, 크기 배제 및 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리(2차 및 3차)하였다. UPLC-ESI-MSMS를 이용하여 살조 활성을 나타내는 저분자량의 신규 테트라펩타이드를 동정하였다. 유해 조류를 제어하기 위한 친환경적인 방법 중에서도 펩타이드는 매우 신속하게 효과를 나타내며 2차 오염이 적다. 또한, 살조제를 현장에 적용하기 위해서는 살조제 물질의 작용 기전에 대한 연구가 필요하다. 그러나 유해 조류에 대한 살조 펩타이드의 기작에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. Chapter 2에서는 테트라펩타이드 처리한 유해조류의 생화학적(esterase, reactive oxygen species) 및 형태학적 변화를 관찰하여 사멸 기전을 조사하였다. 이전에 보고된 다른 살조 펩타이드는 원형질막 파괴와 살조 활성이 동시에 발생했지만, 테트라펩타이드는 조류 세포에 침투하여 생화학적 변화를 나타냈으며, 이는 형광 프로브와 결합된 테트라펩타이드를 이용한 공초점 현미경으로 확인되었습니다. 또한, 테트라펩타이드 유도체와의 비교 분석을 통해 테트라펩타이드가 기존의 살조제 펩타이드와 다른 독특한 살조제 기전을 가지고 있음을 확인하였다. 우수한 항생제로 동정된 새로운 테트라펩티드는 동시에 다른 유용한 생리활성을 가질 수 있습니다. 항생제 펩타이드는 이미 다양한 연구에서 항당뇨병, 항염증, 대사질환 효소 억제, 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있어 의약품 및 다른 용도의 제제로 많이 연구되고 있습니다. 특히, 항생제 펩타이드는 분자적 작용 역학이 항암 펩타이드와 유사하기 때문에 항암 활성을 갖는다. Chapter 3에서는 산업적 응용에 대한 폭넓은 활용을 위해 테트라펩타이드의 항암 및 대사효소 저해 활성을 분석하였다. 테트라펩타이드 유사체는 생화학적 안정성 및 항암 활성을 증가시키기 위해 유용한 스캐폴드 펩타이드를 삽입하여 설계되었습니다. 인공 신경망을 이용하여 테트라펩타이드 유사체의 용혈 활성을 분석하였고, 설계된 테트라펩타이드 유사체는 매우 낮은 확률로 용혈 효과를 갖는 것으로 계산되었다. 전산 염기서열 분석에서는 유사체의 항암 활성 확률이 낮았지만 실제로 HepG2 및 AGS 암세포에 대해 우수한 항암 효능을 보였다. 또한, tetrapeptide 유사체는 트립신에 대한 우수한 내성을 보였다. 테트라펩티드 유사체는 항당뇨병(알파-아밀라제) 및 대사 효소(아세틸콜린에스테라제, HMG-coA 환원효소)의 억제 활성을 포함한 다양한 생체 활성에 대해 분석되었습니다. 또한, 본 연구에서 개발된 테트라펩타이드 및 유사체는 매우 짧고 분자량이 낮아 생산원가를 낮출 수 있고 경제적이다. 또한 테트라펩타이드 유도체들은 trypsin에 뛰어난 저항성이 나타났다. 테트라펩타이드 유도체들은 antidiabetic(alpha-amylase) 및 대사 관련 효소(acetylcholinesterase)의 저해활성을 측정하여 다양한 생리학적 활성을 분석하였다. 또한, 알려진 긴 항생 및 항암펩타이드와 달리 본 연구에서 개발된 테트라펩타이드 및 유도체들은 매우 짧은 저분자이기 때문에 생산단가를 낮출 수 있어 경제적이다. 본 연구는 새로운 테트라펩티드 정제, 동정 방법 및 독특한 살조 기전에 대한 기본 정보를 제공하고 우수한 항생제 및 항암제로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다.