Control of White Spot Disease (WSD) by RNA interference targeting virus ribonucleotide reductase in shrimp

Abstract

White spot syndrome virus (WSSV) has been the major pathogen that can lead to a huge economic loss in cultured shrimp. Many studies have shown that long double-stranded RNAs (dsRNA) targeting essential genes of WSSV induced a sequence-specific antiviral response through RNA interference, systemically. To protect shrimp against WSSV using long dsRNA inducing RNA interference, it is needed to know how we use long dsRNA effectively. In the present study, in vitro synthesized dsRNAs were used to inhibit WSSV replication. The antiviral effect of each dsRNA treatment was measured by survival rate and remained virus copy number. The result showed that dsRNA targeting the ribonucleotide reductase small subunit was the most effective, even at a low dose (100 ng long dsRNAs/shrimp body weight (g)) could induce protection. And long dsRNA was effective in triggering protection of shrimp against WSSV even after 28 days of the administration by about 1 μg long dsRNA. However, the protective effect was different depending on the length and sequence, even within the same target gene. Also, small interfering RNA (siRNA) could not protect shrimp against WSSV in this study. It can be expected that administration of rr2-targeting long dsRNA longer than 320 nt can protect L. vannamei for at least 28 days.

흰반점바이러스 (white spot syndrome virus, WSSV)는 새우 흰반점병을 일으키는 원인 병원체로서, 1992년 대만에서 최초로 보고된 이래 현재까지 전 세계에서 보고되며 양식 새우에 큰 피해를 일으키고 있다. 전 세계적으로 새우흰반점바이러스병을 제어하기 위한 다양한 연구가 진행되었고, 그중 한 가지로 long double-stranded RNA (dsRNA)를 기반으로 RNA 간섭을 이용한 방법이 있다. 무척추동물에서 long dsRNA를 기반으로 하는 RNA 간섭은 전신적으로 sequence-specific antiviral response를 나타내기 때문에 강력한 바이러스성 질병 제어 기술로 활용될 수 있다. 본 연구에서는 RNA 간섭 기작을 기반으로 새우흰반점바이러스병을 제어하기 위하여 최적 조건의 dsRNA를 발굴하고자 했다. in vitro에서 합성한 long dsRNA와 small interfering RNA (siRNA)를 이용하여 흰다리새우에서의 WSSV viral replication 억제 효과를 실험했으며, 그 효과는 생존율과 qPCR을 통한 virus copy number로 확인했다. 그 결과, WSSV 복제에 주요한 유전자 중 ribonucleotide reductase small subunit (rr2) 유전자를 표적으로 했을 때 가장 효율적으로 억제했다. 또한, 저용량의 long dsRNA (100 ng long dsRNAs/shrimp body weight (g))으로도 방어 효과를 보였으며, 약 1 μg long dsRNA/shrimp body weight (g) 용량으로 최소 28일동안 WSSV로부터 새우를 보호했다. 그러나 rr2 유전자 내에서 long dsRNA의 길이와 target sequence에 따라서 방어 효과는 달랐다. 길이가 640 nt, 320 nt인 long dsRNA는 일정 수준 이상의 방어 효과를 꾸준히 보였지만, 길이가 160 nt인 long dsRNA는 target sequence에 따라 다른 방어 효과를 보였다. 또한, siRNA는 본 연구에서는 어떠한 방어 효과도 없었다. 본 연구의 결과를 통해, dsRNA의 길이가 320 nt 이상의 long dsRNA를 흰다리새우에서 바이러스에 대한 방어효과를 얻기 위해 사용한다면 최소 28일간의 방어효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.