Genetic characteristics and pathogenicity of a novel red sea bream iridovirus mixed subtype Ⅰ/Ⅱ in rock bream

Abstract

The causative agents of red sea bream iridoviral disease (RSIVD) are known as infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV) and red sea bream iridovirus (RSIV). In Korea, RSIV, especially subtype II, has been the main causative agent of red sea bream iridoviral disease since the 1990s. Recently, RSIV-Ku strain, a novel strain mixed with ISKNV and RSIV, was isolated from cultured red sea bream (Pagrus major) in Taiwan, suggesting the possibility of genetic variation in the aquatic environment. In this study, RSIV infection was identified in Japanese sea bass (Lateolabrax japonicus) and rock bream (Oplegnathus fasciatus) among Korean cultured fish, and the two RSIV isolates were had different subtypes on the phylogenetic analysis based on the major capsid protein (MCP) and the adenosine triphosphatase (ATPase) protein genes. The complete genome and pathogenicity were analyzed to find out the differences between 17SbTy (RSIV mixed subtype I/II isolated from the Japanese sea bass) and 17RbGs (RSIV subtype II isolated from the rock bream). Complete genome sequences revealed that 17SbTy and 17RbGs genomes are 112,360 and 112,235 bp long, respectively (115 and 114 open reading frames [ORFs], respectively). According to nucleotide sequence homology with representative RSIVs, 69 of 115 ORFs of 17SbTy are most closely related to subtype II (98.48–100% identity), and 46 to subtype I (98.77–100% identity). In addition, two isolated RSIVs in this study compared genetic variants with Ehime-1 strain (RSIV subtype I) reported in Japan and RBIV strain (RBIV subtype II) in Korea. As the result, RSIV subtype I/II (17SbTy isolate) and RSIV subtype II (17RbGs isolate) carried two insertion/deletion mutations (InDels) (ORFs 014R and 102R on the basis of the 17SbTy) in regions encoding functional proteins (a DNA-binding protein and a myristoylated membrane protein). The survival rates of RSIV subtype I/II (17SbTy isolate) or RSIV subtype II (17RbGs isolate) infected rock bream differed significantly. It indicated that the genomic characteristics and/or adaptations to their respective original hosts might influence pathogenicity. The transmission assessment based on the maximum RSIV shedding ratio of inoculated rock bream suggested that the RSIV subtype I/II could have a relatively lower risk than that of infection with RSIV subtype II. In addition, the analysis of the odds ratio based on the spleen index indicated a significantly different that RSIV subtype II infected rock bream was 19.38 but RSIV subtype II was 55.00, supporting the virulence difference of RSIV isolates to rock bream. Especially, in a cohabitation challenge test that mimicked natural conditions, the cumulative mortality of the donor (RSIV-injected rock bream) and the recipient (cohabited naïve rock bream) was significantly lower in the RSIV subtype I/II exposed group than RSIV subtype II exposed group, supporting the correlation between genetic mutation and pathogenicity. To identify the infection mechanism of two RSIVs which has differences in pathogenicity to rock bream and genetic characteristics, the expression of the viral and apoptosis-related genes were analyzed after RSIVs inoculation to rock bream. The expressions of the viral gene (DNA binding protein and myristoylated membrane protein) including the notable InDels region and that of caspase-8 related to apoptosis in rock bream were up-regulated with significantly differences between two RSIVs infected rock bream at 11 days post-infection. It might be related to the difference of viral replication between 17SbTy and 17RbGs in the early stages. Furthermore, although viral genes were highly expressed and caspase-8 was upregulated in early infection stages, the low expression of caspase-3 (activated by caspase-8) may have inhibited apoptosis, reflecting differences in virulence between different RSIV isolates. In conclusion, several virulence factors, including pathogenicity, viral shedding ratio, odds ratio, and gene expression in genetic different RSIV (RSIV subtype I/II and RSIV subtype II) infected rock bream, support that RSIV mixed subtype I/II may be a less pathogenic RSIV strain compared with general RSIV subtype II in a natural aquatic environment.

참돔이리도바이러스병(red sea bream iridoviral disease, RSIVD)의 원인체는 infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)와 red sea bream iridovirus (RSIV)로 알려져 있다. 국내에서 1990년 후반부터 돌돔, 참돔 등의 해산어류에서 RSIVD 발생이 보고되었으며 주 원인체는 RSIV subtype II형이다. 최근 대만의 양식 참돔에서 ISKNV와 RSIV가 혼합된 새로운 변이주인 RSIV-Ku strain이 확인되어 수계 환경 중 유전자 변이의 가능성이 제시된 바 있다. 본 연구에서는 국내 양식 어류 중 농어(Japanese seabass, Lateolabrax japonicus)와 돌돔(Rock bream, Oplegnathus fasciatus)에서 RSIV 감염을 확인하였으며, major capsid protein (MCP)와 adenosine triphosphatase (ATPase) 유전자 염기서열을 통한 계통학적 분석 시 다른 유형의 RSIV인 것을 확인하였다. 서로 다른 유전적 특징을 가지는 RSIV (농어로부터 분리한 subtype I/II 혼합형인 17SbTy 및 돌돔으로부터 분리한 RSIV subtype II)에 대한 차이점을 알고자 전체 게놈을 분석하였으며, 돌돔에 대한 두 분리주의 병원성을 분석하였다. RSIV subtype I/II (17SbTy isolate)와 RSIV subtype II (17RbGs isolate)의 전체 게놈 서열은 각각 112,360, 112,235 bp 길이임을 밝혀냈다. 17SbTy isolate의 전체 open reading frame (ORF) 115개 염기서열에 대한 참조 서열들광의 상동성을 분석 한 결과, 69개의 ORF는 RSIV subtype II (98.48–100% 상동성), 46개의 ORF는 subtype I (98.77–100% 상동성)과 가장 유전적 상동성이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 일본에서 보고한 Ehime-1 strain (RSIV subtype I)과 국내 RBIV strain (RBIV subtype II)와 본 연구에서 분리된 RSIV와의 유전적 변이를 비교하였다. 그 결과 RSIV subtype I/II (17SbTy isolate)와 RSIV subtype II (17RbGs isolate)는 기능성 단백질(DNA-binding protein 과 myristoylated membrane protein)을 암호화하는 영역에서 두 개의 insertion/deletion 변이(17SbTy 기준 ORF 014R 및 102R)를 가지고 있다. RSIV subtype I/II (17SbTy isolate)와 RSIV subtype II (17RbGs isolate)를 돌돔에 인위 감염 시 감염된 돌돔의 생존률은 그룹 간의 유의적인 차이를 보였다. 이는 게놈 특성 또는 각각의 원래 숙주에 대한 적응이 병원성에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 인위 감염된 돌돔의 최대 RSIV shedding ratio로부터 RSIV 전파에 대한 평가 시 RSIV subtype I/II 감염은 RSIV subtype II에 비해 상대적으로 낮은 위험성을 보이는 것으로 확인되었다. 또한, 돌돔의 spleen index 수치를 기반으로 두 RSIV 감염에 대한 odds ratio을 분석 시 RSIV subtype I/II는 19.38인 반면 RSIV subtype II 감염 시 55.00로 유의적인 차이를 보였으며 이는 RSIV 간 돌돔에 대한 병원성 차이를 뒷받침하였다. 특히, 자연 수계 환경 조건을 모방한 cohabitation 감염 실험에서 donor (RSIV 복강 접종 돌돔)와 recipient (donor와 함께 수용된 돌돔)의 누적 사망률은 RSIV subtype I/II 노출이 RSIV subtype II 노출 그룹에서 유의하게 낮아 유전적 변이와 병원성 간의 상관관계를 뒷받침했다. 유전적 및 돌돔에 대한 병원성 차이를 보이는 두 RSIV의 돌돔에서의 감염 기작을 확인하고자 각각의 RSIV를 돌돔에 인위 감염 후 바이러스 자체 및 돌돔의 세포자멸사(apopotosis) 관련된 유전자들의 발현을 분석하였다. 인위감염된 돌돔에서 insertion/deletion변이 (InDels) 부위인 DNA-binding protein 과 myristoylated membrane protein 과 세포자멸사와 관련된 caspase-8의 발현은 감염 후 11일 동안 두 RSIV 분리주 사이의 유의한 차이를 보이며 up-regulation되었다. 이는 두 분리주의 감염 초기 단계의 바이러스 복제 정도의 차이와 관련될 수 있다. 또한, 초기 감염 단계에서 바이러스 유전자와 caspase-8의 높은 발현과 달리, caspase-8에 의해 활성화 되는 caspase-3의 낮은 발현은 바이러스가 세포자멸사를 억제했을 수 있으며, 이는 서로 다른 RSIV 분리주 사이의 독성 차이를 반영한다. 결론적으로 유전적 특징이 다른 RSIV subtype I/II과 RSIV subtype II의 돌돔에 대한 병원성, viral shedding ratios, odds ratio, 유전자 발현을 포함하는 다양한 요소들은 RSIV subtype I/II 혼합형이 자연 수계 환경에서 일반적인 RSIV subtype II에 비해 비교적으로 병원성 및 전파력이 낮은 형태의 RSIV variants일 수 있다는 것을 뒷받침한다.