별불가사리 (Patiria pectinifera) 에서 분리한 항균성 펩타이드, PpMAMP의 생화학적 특성에 관한 연구

Abstract

동물, 식물 및 미생물들은 외부 물질의 침입으로부터 자신을 방어하기 위해 항균 활성 기능을 발휘하는 물질을 생산한다. 특히 그 중에서 항균성 펩타이드(AMP)는 무척추동물의 선천성 면역 방어 체계에서 중요한 역할을 한다. AMP는 많은 생명체에서 발견되고 있지만, 해양동물로부터는 아직까지 다양한 종류의 AMP가 발견되지 않고 있다. 본 논문은 이전 연구에서 별불가사리 (Patiria pectinifera)의 근육 추출물로부터 부분적으로 정제한 새로운 AMP의 분자생물학 및 생화학적 특성에 대해 조사하였다. 정제된 펩타이드는 1개의 S-S 결합을 형성하는 2개의 시스테인(C6-C18)을 포함하는 21개의 아미노산을 가지고 있다. 이 펩타이드를 편의상 P. pectinifera muscle antimicrobial peptide (PpMAMP)라 명명하였다. cDNA 클로닝을 통하여 PpMAMP의 전구체 단백질에 대한 전체 뉴클레오타이드 서열을 얻었다. PpMAMP의 전체 뉴클레오타이드 서열은 1,486 bp로 구성되어 있다. 이 서열은 96 bp로 구성된 5’UTR, 309 bp로 구성된 ORF, 그리고 1,081 bp로 구성된 3’UTR을 포함하고 있다. PpMAMP의 전구체 단백질은 18개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 14개의 아미노산으로 구성된 intermediate 영역, 21개의 아미노산으로 구성된mature peptide 및 49개의 아미노산으로 구성된 또 다른 영역을 포함하고 있다. 또한 cDNA cloning 결과로 부터 PpMAMP (PpMAMP-1)의 서열과 유사한 5개의 isotype을 밝혀냈다. 이들 isotype 중 4개 (PpMAMP-3, 4, 5, 및 6)는 전구체 단백질에 W24와 H25가 존재하지 않는다. PpMAMP와 유사하게 PpMAMP-3 전구체 단백질은 18개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 12개의 아미노산으로 구성된 intermediate 영역, 21개의 아미노산으로 구성된 mature peptide 및 49개의 아미노산으로 구성된 영역을 포함하고 있다. PpMAMP의 항균 활성을 조사하기 위해서 Ultrasensitive radial diffusion assay를 사용하였다. PpMAMP는 그람 양성균 중 Bacillus subtilis KCTC 1021과 그람 음성균 중 Shigella flexneri KCTC 2517에 대하여 가장 강한 항균 활성을 보였다. Cys6과 Cys18 사이의 S-S 결합이 항균 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 해당 Cys 잔기를 Ala으로 치환한 펩타이드 ([Ala6, Ala18]-PpMAMP)를 합성하였다. 합성한 유도체는 측정한 균주 Bacillus subtilis KCTC 1021, Escherichia coli ML35 ATCC 43827 및 Salmonella enterica ATCC 13311 에 대해 항균 활성이 유지되었다. 이러한 결과는 S-S 결합이 항균 활성을 나타내는데 필수적인 역할을 나타내지 않는다는 것을 의미한다. 생체막과 PpMAMP 및 [Ala6, Ala18]-PpMAMP의 상호작용에 대한 연구를 하기 위하여, NPN uptake, ONPG, 그리고 DNA 결합 실험을 시행하였다. 그 결과, PpMAMP와 [Ala6, Ala18]-PpMAMP는 Escherichia coli ML35의 외막과 상호작용하며, 특히 PpMAMP는 DNA와 결합하는 것이 관찰되었다. 흥미롭게도, NPN uptake 실험 결과에 의하면 [Ala6, Ala18]-PpMAMP는 PpMAMP보다 상대적으로 외막과 더 잘 상호작용을 하는 것이 관찰되었다. 아마도 PpMAMP와 [Ala6, Ala18]-PpMAMP의 실험에 대한 결과의 차이점은 S-S 결합의 존재 여부로 인한 구조적 차이점 때문에 발생한 결과라 여겨진다. 인슐린 및 인슐린 유사 펩타이드의 전구체 서열은 signal peptide, D peptide, B-chain, C peptide, A chain을 포함한다. cDNA를 통해 확인된 PpMAMP의 전구체 단백질의 구조는 인슐린과 인슐린 유사 펩타이드 전구체 단백질의 구조와 유사하였다. PpMAMP와 인슐린 및 인슐린 유사 펩타이드에서의 시스테인 위치 보존에 근거하여 볼 때, PpMAMP는 인슐린 및 인슐린 유사 펩타이드 family에 포함될 가능성을 지닌다. 그러므로 PpMAMP와 인슐린 및 인슐린 유사 펩타이드 구조의 비교는 PpMAMP가 인슐린, GSS, Con-Ins GI, 그리고 Bombyxin의 B-chain과 유사한 구조를 가지고 있다는 것을 보여준다. 청자 고둥에서 분비되는 마비독 중의 하나인 Con-Ins G1은 인슐린 유사 펩타이드로 알려져있다. Con-Ins G1은 청자 고둥의 먹이에게 저혈당을 유발하여 청자 고둥이 먹이를 쉽게 포식할 수 있게 하는 역할을 한다. PpMAMP가 새우에서 마비효과를 유발하여 새우의 행동에 변화를 야기하는지 조사하기 위하여 흰다리 새우 (Litopenaeus vannamei)에 PpMAMP를 접종하였다. 그 결과, 다양한 농도의 PpMAMP 접종은 흰다리 새우의 행동에 마비 효과를 유도하였다. 그러나, 이 행동의 변화가 새우의 저혈당에 의해 기인한 것인지 다른 요인에 의해 변화가 발생했는지에 대한 여부를 확인하기 위해서는 후속 연구가 진행되어야 한다. 종합적으로, 별불가사리 (Patiria pectinifera)로부터 유래한 PpMAMP는 그람 양성균과 그람 음성균에 대해 항균 활성을 나타내며, 새우에 대해 일시적인 마비효과를 나타내었다. 또한 PpMAMP는 인슐린 유사 펩타이드의 B-chain과 구조적으로 유사한 특징을 지니고 있다. 따라서 PpMAMP는 항균성 기능과 마비 효과 기능을 동시에 가지는 새로운 항균 활성 펩타이드로, 불가사리의 선천성 면역반응에 작용하는 것으로 보여진다.

S-S 이중결합 존재 : PpMAMP : R-S-P-H-Y–C-G-R-H-L-G-T-K–I–G-Q-I-C-G-W-H

[Ala6, Ala18]-PpMAMP : R-S–P-H-Y-A-G-R-H-L-G-T-K-I-G-Q-I–A-G-W-H

Antimicrobial peptides(AMPs) are major components of the immune defense system in invertebrates. AMPs are found in many forms of life. However, there have been merely few reports of AMPs in the animals from the ocean. Here, I report the identification and characterization of a previously isolated novel antimicrobial peptide from the muscle extract of the starfish, Patiria pectinifera. The isolated peptide comprises 21 amino acids (AAs), including two cysteine residues that form one disulfide bond(C6-C18), and is designated P. pectinifera muscle antimicrobial peptide (PpMAMP). Cloning of the nucleotide sequence encoding the complete PpMAMP precursor protein was performed by 3’ and 5’ rapid amplification of cDNA ends polymerase chain reaction. The complete nucleotide sequence of PpMAMP comprises 1,486 bp which include 5’UTR of 96 bp, ORF of 309 bp, and 3’ UTR of 1,081 bp. The PpMAMP precursor protein comprises a signal peptide of 18 AAs, two propeptides of 14 AAs and 49 AAs, mature peptide of 21 AAs. Analysis on the cDNA cloning results revealed that PpMAMP (PpMAMP-1) has 5 isotypes (PpMAMP-2, 3, 4, 5, 6). Among these isotypes, four (PpMAMP-3, 4, 5, 6) did not have W24 and H25 in the precursor protein. The complete nucleotide sequence of PpMAMP’ isotype (PpMAMP-3) comprises 1,501 bp which include 5’UTR of 103 bp, ORF of 303 bp, and 3’ UTR of 1,094 bp. The PpMAMP-3 precursor protein comprises a signal peptide of 18 AAs, two propeptides of 12 AAs and 49 AAs, mature peptide of 21 AAs. The structure of PpMAMP’s precursor protein was similar to those of insulin and insulin-like peptides. On the basis of the cysteine position conservation among PpMAMP and insulin/insulin-like peptides, it is highly likely that PpMAMP belongs to insulin/insulin-like peptide family. Comparison of PpMAMP’s and insulin/insulin-like peptides’ structures showed that PpMAMP was similar to B chains of insulin, GSS, Con-Ins G1, and Bombyxin. Ultrasensitive radial diffusion assay was utilized to measure the antimicrobial activity of PpMAMP against various bacterial strains. PpMAMP showed the most potent antimicrobial activity against gram positive bacterium, Bacillus subtilis KCTC 1021, and gram negative bacterium, Shigella flexneri KCTC 2517. To investigate the effect of the disulfide bond between Cys6 and Cys18, the antimicrobial activity of the peptide with the cysteine residues substituted with alanine, which was designated [Ala6, Ala18]-PpMAMP, was measured. The results showed that the disulfide did not hold any critical role in exerting antimicrobial activity. NPN (1-N-phenylnapthylamine) uptake, ONPG (ortho-Nirophenyl-β-galactoside), and DNA binding assays were conducted to investigate PpMAMP and [Ala6, Ala18]-PpMAMP’s mode of action. The results of these assays revealed that PpMAMP and its analog interact with the outer membrane of Escherichia coli ML35 and that PpMAMP binds with DNA molecules indicating PpMAMP exerts antimicrobial activity through multiple mechanisms. Interestingly, the results of NPN uptake assay showed that [Ala6, Ala18]-PpMAMP was more capable of interacting with the outer membrane of the bacteria compared to PpMAMP suggesting the removal of the disulfide bond contribute to increased interaction with the outer bacterial membrane. Insulin and insulin-like peptides can cause glycemia affecting the animals’ behaviors. Con-Ins G1 was postulated to paralyze cone snails’ preys making the preys vulnerable to predation. To investigate whether PpMAMP can cause glycemia in shrimps affecting their behaviors, PpMAMP was injected to the white-legged shrimp, Litopenaeus vannamei. The results indicated that shrimps’ behaviors were affected by PpMAMP injection. However, further studies are required to confirm that this change in shrimps’ behaviors is due to glycemia. In conclusion, PpMAMP is a novel antimicrobial polypeptide that is structurally similar to the B-chain of insulin-like peptides identified from the starfish, Patiria pectinifera.