A Disposable, Pressurized, and Self-contained Cartridge for Performing Automated Bacterial Nucleic Acid Extraction

Abstract

분자 진단은 유해한 병원체를 신속하고 정확하게 검출하기 위하여 사용되는 중요한 접근법 중 하나로 이를 수행하기 위해서는 핵산인 DNA 또는 RNA를 샘플에서 분리 및 정제해야 합니다. 널리 사용되는 방법 중 하나인 컬럼 기반 핵산 추출은 사용이 안전하고 용이하며 다양한 출발 물질의 처리가 가능하고 결과의 재현성을 지닙니다. 그러나 이 방법은 각 과정 사이 여러 pipetting 단계가 존재하며 탁상형 원심분리기를 사용해야 하기에 숙련된 기술자가 필요합니다. 따라서 본 연구에서는 closed-system 방식을 사용하여 미리 저장된 시약으로 세포 용해 및 자동 핵산 정제를 수행할 수 있는 가압 카트리지를 제안합니다. 카트리지에는 시약이 미리 저장된 3D 인쇄 튜브 홀더 4세트와 silica membrane이 장착된 미세 유체 칩 및 DNA 농축에 사용되는 바늘이 포함되어 있으며 용해 buffer를 포함하는 구획화 3D 인쇄 튜브는 튜브 어레이에서 분리될 수 있습니다. Closed-system을 유지하고 교차 오염을 방지하기 위해 외부 pumping이나 복잡한 밸브에 의존하지 않으며 시약과 시료는 튜브 내부에 저장된 가압 공기로 인해 미세 유체 칩의 실리카 막을 통하여 입구 튜브에서 출구로 이동합니다. Closed-system을 유지하고 교차 오염을 방지하기 위해 시약과 시료는 튜브 내부에 저장된 가압 공기로 미세 유체 칩의 실리카 막을 통해 입구 튜브에서 출구로 이동하며 외부 pumping이나 복잡한 밸브에 의존하지 않습니다. 이 장치는 용해시간 33분과 자동 핵산 정제 시간 3분을 포함하여 36분 이내에 고도로 정제된 대장균(E. coli) O157:H7 DNA을 추출할 수 있습니다. Cartridge를 이용하여 추출한 DNA는 rfbE 유전자를 대상으로 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)을 수행하였을 경우 E. coli DNA에 대하여 103 CFU의 검출한계를 나타내며, 이는 상용 핵산추출키트와 유사한 농도, 순도 및 유사한 검출한계를 나타냅니다. 본 연구에서 제안된 카트리지는 현장 진단을 위한 solid-phase 핵산 추출을 자동화하는 새로운 방법을 보여줍니다.|Molecular diagnostics is one of the most important approaches to rapidly and precisely detect harmful pathogens. To perform the test, nucleic acid, either DNA or RNA, needs to be extracted and purified from the sample. One of the most popularly used methods is column-based nucleic acid extraction. Compare to liquid-phase extraction, it is safer, easier to handle, reproducible, can extract process different kind of samples (water, plant, blood, etc.), and can be done within 1 hr. However, this method still requires bulky equipment such as centrifuge, a trained technician to perform, and multiple pipetting in between. Here, we propose a pressurized cartridge with pre-stored reagents that can perform cell lysis and automated DNA purification in a closed-system manner. The cartridge contains a 3D-printed tube holder consisting of four sets of tubes with pre-loaded reagents and a microfluidic chip equipped with silica membrane and needles is used to concentrate DNA. The compartmentalized 3D-printed tube containing lysis buffers can be separated from the tube array. To maintain a closed system and prevent cross-contamination, reagents and sample are moved from one tube to another through the silica matrix in the microfluidic chip with the help of air compressed inside the tubes instead of reliance on peripheral pumping system or intricate valving system. The device can extract highly purified Escherichia coli (E. coli) O157:H7 DNA within 36 min, including 33 min of lysis and 3 min of automated nucleic acid purification. Extracted DNA using the cartridge shows similar concentration, purity, and comparable limit of detection, which is 103 CFU for E. coli DNA when performing real-time PCR targeting rfbE gene compared to that of conventional bacterial DNA extraction protocol. The proposed cartridge demonstrates a new method to automate the solid-phase DNA extraction for point-of-care testing.