Applicability of diagnostic methods at different white spot syndrome virus infection levels

Abstract

흰반점병(white spot diasease; WSD)은 1992년 대만에서 처음 보고된 이후로 현재까지도 전 세계적으로 양식 새우류에 대량 폐사를 유발하는 주요 병원체이다. 흰반점병의 원인 병원체인 흰반점바이러스(white spot syndrome virus; WSSV)는 급성 감염단계에서의 높은 병원성을 띄며, 주로 수인성 수평전파를 통해 질병이 확산되기 때문에 감염 초기단계에서의 진단 및 해수 내 바이러스의 검출은 질병 발생 및 확산 방지에 매우 중요한 요소이다. 본 연구에서는 다양한 WSSV감염수준에서 진단법들(2-step PCR, real-time PCR, alternative PCR, 및 상용화 POCT)의 적용 가능성을 확인하기 위하여, 각 진단법들의 95% 검출 한계 값(LOD95% value)를 분석하였으며, first-PCR, nested-PCR, real-time PCR, alternative PCR 및 상용화 POCT의 LOD95% value는 각각, 51.05 (95% CI, 33.67 – 116.46), 0.70 (95% CI, 0.43 – 1.86), 4.67 (95% CI, 3.41 – 9.77), 1.19(95% CI, 0.73 – 2.89), 그리고 79,434.65 (95% CI, 53,261.08 – 178,899.86) viral DNA copies/reactions으로 나타났다. WSSV 감염 새우로부터 viral shedding rate를 조사하기 위해서 철 이온 응집법(iron flocculation method)을 적용하여 해수 중 바이러스를 농축하였다. 철 이온 응집 과정에서의 여과 필터 및 버퍼 조건에 따라 해수 중 WSSV농축 수율을 분석한 결과, poly carbon filter 및 ascorbate버퍼를 사용 시 해수 내 WSSV genome copy 농축 수율이 93.74% ± 7.44%로 가장 높은 것으로 나타났다. 흰다리새우에 대한 WSSV농도별 인위감염 실험을 통하여 WSSV 감염수준을 병리조직학적 특징(조직 내 inclusion body의 비율; G0-G4) 및 real-time PCR 상의 CT value를 바탕으로(negative result-heavy infection) 5단계로 분류하였다. Moderate infection (CT value: 24.83-29.33) 및 G2 (30-40%의 inclusion bodies 비율) 이상의 감염 수준에서 흰다리새우의 폐사가 발생하기 시작하였으며, 감염된 새우로부터의 바이러스 방출은 light infection 및 G1 수준에서도 나타나는 것으로 확인되었다. 더 나아가, 가장 낮은 LOD95% value를 보인 nested PCR에 대한 각 진단법들의 설정된 감염 수준에 따른 진단 민감도(diagnostic sensitivity; DSe) 및 진단 특이도(diagnostic specificity; DSp)를 분석하였으며, real-time PCR 및 alternative PCR의 경우 light infection 및 G1–G2의 감염수준에서 93.8% 이상의 진단 민감도(DSe)를 보였다. POCT의 경우 10분 내외의 신속한 검사시간 내에 severity 및 G2–G3이상의 감염수준에서 89.3%이상의 진단 민담도(DSe)를 보이며 현장 수준에서의 적용 가능성을 확인하였다. 본 연구의 결과를 바탕으로, 흰반점병의 감염 초기단계에서 기존 WOAH에서 권고하고 있는 2-step PCR 뿐만 아니라, nested PCR과 비교하여 93.8% 이상의 우수한 DSe를 보인 real-time PCR 및 alternative PCR의 활용성을 확인할 수 있었으며, 더 나아가 현장 수준에서는 PCR을 이용한 진단 뿐만 아니라, moderate infection 이상 단계에서 89.3%의 DSe를 보인 POCT kit를 통한 신속한 진단법의 활용성을 확인할 수 있었다. 급성 감염에서WSSV의 높은 병원성과, 후천 면역이 다소 덜 발달한 WSSV의 주된 숙주인 흰다리새우의 특성으로 인하여 감염 초기단계에서의 진단은 매우 중요한 실정이다. 본 연구에서는 WSSV에 감염된 흰다리새우의 병리조직학적 및 real-time PCR의 CT value를 바탕으로 감염 수준을 분류하였으며, 감염초기단계(G1-G2; light-moderate infection)에서의 real-time PCR 및 alternative PCR, 그리고 중감염 단계(G2-G4; moderate-serious infection)에서의 POCT kit를 활용한 신속한 WSSV검사는 양식환경에서의 WSD 로 인한 대량폐사 및 확산을 방지하는데 큰 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.