Enhancement of bioethanol production from Eucheuma denticulatum using the CRISPR Cas9 system and galactose adaptive evolution
- Alternative Title
- Eucheuma denticulatum로부터 CRISPR-Cas9 시스템과 갈락토즈 적응진화를 이용한 바이오에탄올 생산력 향상
- Abstract
- 과도한 화석연료의 사용으로 이상기후 발생, 이산화탄소 축적 등의 다양한 환경문제로 인하여 바이오매스가 화석연료의 대체 에너지원의 하나로 대두되고 있다. 바이오매스는 화석연료와 비교하여 탄소 배출량이 적어 지속적인 친환경 에너지원으로 사용가능하다. 그 중 바이오에탄올 생산이 가능한 해조류는 1, 2세대 육상계 바이오매스의 문제점을 해결할 수 있다는 점에서 더욱 주목 받고 있다. 따라서, 비식용 해조류를 에너지원으로 활용하여 바이오에탄올을 생산하고, 친환경 대체 에너지 생산률 증가에 이바지할 수 있을 것이며, 국내의 신재생 에너지 공급 및 활용에 기여하고자 한다.
본 연구에서는 바이오매스로 탄수화물 함량이 비교적 높은 홍조류의 한 종류인 Eucheuma denticulatum을 이용하여 바이오에탄올을 생산하고자 하였다. 10 %(w/v) 슬러리 농도, 300 mM 농도의 질산(HNO3), 121℃에서 90분 동안 처리하는 열산가수분해를 진행한 후, 20 units/mL의 상업적 효소인 Cellic CTec2를 사용하여 효소당화를 진행하였다. 이 후 발효 저해제인 5-HMF를 제거하기 위해 2 %의 활성 탄소(activated carbon)를 첨가하여 50℃에서 2분간 처리하여 E. denticulatum 가수분해물을 얻었다.
에탄올 수율 개선을 위해, 1장에서 Saccharomyces cerevisiae, Candida lusitaniae, Kluyveromyces marxianus 3가지 균주를 이용해 고농도 galactose에 적응진화(adaptive evolution)하여 wild-type 균주들과 에탄올 생산능을 비교하였다. 2장에서는 S. cerevisiae가 galactose를 섭취하여 에탄올을 생산하는 pathway에 관여하는 유전자인 MIG1과 세포 호흡에 관여하는 COX9을 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 각각 조작하였고, 유전자가 조작된 균주들을 사용하여 호기적 발효와 혐기적 발효를 동시에 진행하였다. 이 재조합 균주들과 wild-type 균주, 적응 진화한 균주를 이용한 발효를 통해 glucose와 galactose의 섭취와 에탄올 생산성의 변화를 비교하였다.
- Issued Date
- 2023
- Awarded Date
- 2023-02
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Alternative Author(s)
- Jieun Kim
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 해양수산생명과학부 생물공학전공
- Advisor
- 정귀택
- Table Of Contents
- Chapter. Ⅰ. Enhancement of galactose consumption for bioethanol production from Eucheuma denticulatum hydrolysate using galactose-adapted yeasts 1
1.1. introduction 2
1.2. Materials and Methods 6
1.2.1. Raw Material 6
1.2.2. Thermal acid hydrolysis pretreatment 6
1.2.3. Enzymatic saccharification 7
1.2.4. Removal of 5-HMF from E. denticulatum 7
1.2.5. Pretreatment of galactose-adapted microorganisms 8
1.2.6. Ethanol fermentation at by Erlenmeyer flasks 8
1.2.7. Ethanol fermentation in a 5L-fermentor 9
1.2.8. Transcriptional level analysis 10
1.2.9. Analytical methods 12
1.3. Results and Discussion 13
1.3.1. Composition of Eucheuma denticulatum 13
1.3.2. Effect of thermal acid hydrolysis condition 13
1.3.3. Effect of enzymatic saccharification 17
1.3.4. 5-HMF removal from E. denticulatum hydrolyzate 20
1.3.5. Ethanol production using Erlenmeyer flasks 24
1.3.6. Ethanol fermentation using galactose-adapted S. cerevisiae in fermentor 27
1.3.7. Analysis of gene transcriptional levels 29
1.4. Conclusion 32
1.5. References 33
Chapter. Ⅱ. A study on the improvement of galactose consumption capacity of Saccharomyces cerevisiae by deletion of MIG1, COX9, and both genes for ethanol fermentation of Eucheuma denticulatum hydrolyzate 41
2.1. Introduction 42
2.2. Materials and Methods 44
2.2.1. Raw biomass and microorganisms 44
2.2.2. Thermal acid hydrolysis and enzymatic saccharification 44
2.2.3. MIG1 and COX9 deletion using CRISPR Cas9 45
2.2.4. Galactose adaptive evolution of yeast 48
2.2.5. Ethanol fermentation 48
2.2.6. Analytical method 49
2.2.7. Real-time qPCR 49
2.3. Results and Discussion 53
2.3.1. Compositions of E. denticulatum 53
2.3.2. Ethanol fermentation 53
2.3.2.1. Ethanol fermentation under aerobic conditions 53
2.3.2.2. Ethanol fermentation under anaerobic conditions 58
2.3.3. Analysis of gene transcriptional levels of strains 63
2.3.3.1. Analysis of gene transcriptional levels of strains under aerobic conditions 63
2.3.3.2. Analysis of gene transcriptional levels of strains under anaerobic conditions 68
2.4. Conclusion 71
2.5. References 73
- Degree
- Master
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- 대학원 > 해양수산생명과학부-생물공학전공
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