Evaluation of the antiviral activity of arctigenin, ribavirin, and ivermectin against viral hemorrhagic septicemia virus

Abstract

바이러스성출혈성패혈증(Viral hemorrhagic septicemia; VHS)는 세계동물보건기구(World Organisation for Animal Health)에서 지정한 어류의 전염병으로 국내에서는 수산생물질병관리법에 따른 법정전염병에 해당된다. 국내에서는 주로 겨울철 저수온기에 발병하여 양식 넙치(Paralichthys olivaceus)의 대량 폐사를 유발하는 상존 질병 중 하나이다. 한편, VHS를 예방하기 위해 다양한 형태의 백신이 개발되었으며 국내에서는 불활화 백신이 상용화(2019년도)되었으나 현장에서의 효과는 아직 보고되지 않은 실정이다. 인체 및 가축에서는 다양한 바이러스성 질병을 제어하기 위해 amantadine, ribavirin, ganciclovir, lactogenin 등이 항바이러스제로 개발되어 상용화되고 있으며, 어류의 경우에도 잉어봄바이러스병, 틸라피아레이크바이러스병 등을 제어하기 위해서 arctigenin, ribavirin 등의 항바이러스제에 대한 연구가 최근 많이 이루어지고 있는 실정이다. 본 연구에서는 인체 및 가축에서 항바이러스 효과를 보인 6가지 화합물인 arctigenin (ARG), ribavirin (RBV), ivermectin (IVM), amantadine, cytarabine, MLN4924을 이용하여 VHSV에 대한 항바이러스제 효능을 평가하고자 하였다. In vitro의 경우 VHSV의 감수성 세포주인 Epithelioma papulosum cyprini (EPC)를 이용하였으며 및 in vivo 실험에서는 넙치의 생존율 및 면역유전자 발현 상관관계를 통해서 항바이러스제 효능을 평가하였다. VHSV에 감염시킨 EPC 세포에 여섯 가지 항바이러스제를 노출시킨 결과, ARG, RBV, IVM을 처리한 세포에서 바이러스 감염 48시간 후의 glycoprotein (G)와 nucleoprotein (N)의 발현이 농도 의존적으로 감소하였으며, 세포 형태 및 생존율에 있어서도 VHSV만 감염시킨 세포에 비해 유의미한 증가를 보였다. 또한, 항바이러스제에 노출된 EPC 세포의 세포 외 바이러스(extracelluar virus) 방출량을 plaque assay를 이용하여 측정한 결과, ARG와 RBV 노출 72시간 후의 바이러스 방출량이 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (ARG 104.68 PFU/mL; RBV 102.55 PFU/mL; naïve VHSV 106.56 PFU/mL). 항바이러스제가 바이러스 복제 주기 및 전처리에 따른 영향을 평가한 결과, ARG 및 RBV은 세포 내 바이러스의 초기 복제를 억제하는 결과를 보였으나 IVM 처리 시 바이러스 복제 주기에 따른 항바이러스 활성을 확인할 수 없었다. 더욱이, RBV 및 IVM의 경우 항바이러스제 전처리된 세포에서 바이러스 유전자 발현량이 감소되는 것으로 확인되었으며 이는 RBV과 IVM이 EPC 세포의 면역 인자를 자극하여 항바이러스 효과가 나타나는 것으로 사료된다. 항바이러스제에 대한 효능을 넙치에서 확인하기 위해 총 8개의 그룹으로 나뉘어졌다. 세 그룹의 경우, 세 가지 각 약제를 바이러스 접종 24시간 전에 노출 (ARG 1.5 μg/fish; RBV 25 μg/fish; IVM 0.75 μg/fish) 시켜 주었고(pre-treated groups), 세 그룹의 경우 약제를 바이러스 접종 24시간 후에 노출(ARG 0.5 mg/kg; RBV 8.33 mg/kg; IVM 0.25 mg/kg)시켜 주었으며(post-treated groups), positive control의 경우 VHSV (104 PFU/fish)만 주사하였고, negative control의 경우 L-15 배지를 주사하였다. 14일 동안의 폐사를 관찰한 결과, RBV-, IVM-pre-treated group에서 각각 66.7%, 73.3%; IVM-post-treated group에서 66.7%의 생존율을 보여 화합물의 투여가 VHSV의 감염으로 인한 폐사를 억제할 수 있음을 확인하였다. 더 나아가 넙치의 생존율 차이에 영향을 알아보고자 선천 면역에 관여하는 유전자 발현을 분석한 결과, RBV-, IVM-pre-treated group, RBV-, IVM-post-treated group에서 바이러스 복제 억제에 관여하는 유전자인 Mx protein의 지속 발현, RBV-, IVM-pre-treated group, IVM-post-treated group에서 pro-inflammatory cytokine 중 하나인 TNF-α의 상향 발현이 관찰되었다. 비록 ARG 투여 개체에서는 생존율의 유의미한 증가 및 해수 내 바이러스 방출량, 개체 내 바이러스 유전자 발현량에서 유의미한 차이를 확인할 수 없었지만, 생존율에서 유의미한 증가를 보였던 RBV 및 IVM에서는 immunostimulatory effect로 인해 넙치의 생존율이 향상되었을 것으로 사료된다. 본 연구에서는 ivermectin 0.25 mg/kg의 낮은 농도에서 VHSV에 대한 항바이러스 효과를 확인하였으나, ivermectin의 경우, 일정 수준 이상의 농도로 어류에 투여할 시 식욕감퇴, 무기력증, 체색흑화 및 폐사 등의 부작용을 유발하였다는 이전의 연구결과가 존재하기에 수계에서 항바이러스제로 ivermectin을 사용할 시 어류에 대한 약제의 부작용 및 환경적 영향에 대한 충분한 평가가 수행되어야 할 것으로 사료된다. 본 연구는 VHSV 항바이러스제 후보물질에 대한 제시 및 바이러스성 질병 억제 전략으로서 항바이러스제 사용 가능성을 제시한다. |Viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) causes a severe and often lethal infection in olive flounder (Paralichthys olivaceus) in Korea, resulting in mass mortality and substantial economic loss. As a potential prevention strategy for infectious viral diseases, this study aimed to evaluate the antiviral activity of three compounds (arctigenin [ARG], ribavirin [RBV], and ivermectin [IVM]) against VHSV infection in vitro and in vivo. In epithelioma papulosum cyprini cells, the expression of both VHSV glycoprotein (G) and nucleoprotein (N) genes were significantly suppressed by the three compounds in a dose-dependent manner (P < 0.05). Also, cell morphology and viability were maintained at the following concentrations: ARG 1.5 mg/L, RBV 2.5 mg/L, and IVM 10 mg/L. The fish that were treated with RBV (8.33 mg/kg) and IVM (0.25 mg/kg) before VHSV infection and those treated with IVM (0.25 mg/kg) after VHSV infection showed significant improvements in the survival rate, a reduction in the viral shedding rate, and downregulation of viral gene expression compared to those seen in fish with naïve VHSV infections. Furthermore, among the innate immune genes studied, persistent expression of Mx and upregulation of tumor necrosis factor-α gene expression in VHSV-infected fish treated with RBV and IVM revealed that these compounds might induce an immunostimulatory effect as one of their antiviral activities. Overall, this study supports the use of RBV and IVM as antiviral agents to control VHSV infections in olive flounder.