보라성게, Heliocidaris crassispina 로부터 항균성 물질의 정제 및 특성
- Abstract
- 보라성게, Heliocidaris crassispina에서 항균성 물질의 정제 및 특성분석
박수현
부경대학교 대학원 해양수산생명과학부 생물공학전공
해양생물은 서식환경의 특성상 높은 밀도의 미생물에 항상 노출되어 있다. 따라서 그들은 항균활성을 가진 생리활성물질을 생성함으로써 스스로를 보호한다. 성게에서 분리된 항균 물질로는 Echinochrome A (Ech A)이 있다. 따라서 본 연구에서는 보라성게의 체강액 열수추출물의 항균활성을 측정하고 항균활성을 나타내는 두 물질(A and B)을 정제하여 분자량을 측정하였다. 그 결과, 성게 체강액 추출물은 다양한 균주에 대해 항균활성을 나타냈으며, 이러한 결과는 성게 체강액 추출물은 새로운 항균요법으로의 가능성을 나타낸다고 여겨진다. 이번연구에서 정제된A 물질의 분자량은 266.0428로 나타났다. 이는 Ech A의 분자량과 매우 유사하며 Histochrome 과의 retention time 비교에서 하나의 peak로 나타났음으로 Ech A라 여겨진다. B 물질은 [M-H]-에서 237.0395, 263.0188, 265.0346, 281.0293 및 299.0396 Da를 가지는 혼합물로 나타났다. Ech A는 강한 항산화성 물질로 알려져 있으며, 산화과정에서 여러 산화 생성물이 생성된다. 혼합물인 B 물질은 Ech A와 그 산화 생성물과 분자량이 거의 동일하기에 B 물질은 Ech A의 산화 생성물이라 여겨진다. 이번 연구에서의 두 물질은 모두 Ech A라 여겨지지만 초기 정제에서 두 물질로 분리되었다. 이는 Ech A의 isomer라 여겨진다. 이전의 연구에서는 주로 이번 연구의 가시와 껍질로부터 강산용액과 유기용매를 사용하여 Ech A를 얻었다. 하지만 이번 연구에서는 이러한 강한 독성 물질을 사용하지 않았음으로 실험자의 위험도를 낮추고 친환경적인 방법이 될 수 있다고 여겨진다.
|보라성게, Heliocidaris crassispina의 내장조직에서 새롭게 정제된 항균성 펩타이드의 특징 및 특성분석
박수현
부경대학교 대학원 해양수산생명과학부 생물공학전공
인류는 항생제 개발을 통해 다양한 병원체를 통제하고자 했다. 하지만 항생제 내성균의 출현은 새로운 위기로 다가왔다. 이에 따라, 내성을 거의 유발하지 않는 항균성 펩타이드 (AMPs)가 주목받고 있다. 특히 보라성게와 같은 무척추동물은 적응 면역이 부족하기 때문에, 선천성면역에 매우 의존적이며 AMPs는 선천성 면역의 중요한 요소라 여겨지고 있다. 따라서 이번 연구에서는 이전에 사용되지 않은 보라성게의 내장 추출물에서 새로운 AMP (HcAMP)를 정제하였다. HcAMP 분자량은 2,132.43 Da이며 17개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다. HcAMP의 서열은 DKGRESKTKQFRIGYRY이며 C-말단의 amide형태로 나타났다. HcAMP 서열의 상동성 검사에서 높은 상동성을 가지는 AMP가 발견되지 않았기 때문에 새로운 유형의 AMP라 여겨진다. HcAMP의 염기서열을 확인하기 위해 cDNA를 clonnig수행하였다. 그 결과, 전체 838 bp의 염기 서열을 확인하였다. RT-qPCR을 이용한 조직별 발현 분석은 성게의 면역에 관련된 coleomocyte에서 가장 높은 발현량을 나타냈다. 또한 HcAMP의 항균활성을 강화하기위해 HcAMP의 Gly잔기를 Ala로 치환한 3종의 유도체인 HcAMP[A3], HcAMP[A14] 및 HcAMP[A3,14]를 합성하였다. 그 결과 HcAMP[A14] > HcAMP[A3,14] > HcAMP > HcAMP[A3]의 순서로 항균활성을 나타냈다. 이번 연구에서 사용한 4종의 peptide는 세균 외막과의 상호작용을 나타냈으나, 내막과의 상호작용은 없는 것으로 나타났다. HcAMP의 N-말단은 항균 활성에 중요한 역할을 하며 C-말단의 Gly는 활성에 미치는 영향이 적기 때문에 이를 치환하여 helix구조를 취하는 것이 항균활성에 더 유리할 것이라 생각된다. 또한 앞으로 항균제로의 개발을 위해 용혈활성과 같은 부작용을 조사할 필요가 있다고 생각된다.
- Issued Date
- 2023
- Awarded Date
- 2023-02
- Type
- Dissertation
- Publisher
- 부경대학교
- Affiliation
- 부경대학교 대학원
- Department
- 대학원 해양수산생명과학부 생물공학전공
- Advisor
- 박남규
- Table Of Contents
- Part I. Screening and purification of antimicrobial materials from coelomic fluid of sea urchin, Heliocidaris crassispina 1
영문초록 2
1. 서론 3
2. 재료 및 방법 8
2.1 실험 동물 및 조직 8
2.2 보라성게의 체강액으로부터 추출물 조제 8
2.3 항균활성 측정 9
2.3.1 사용 균주 및 배양조건 9
2.3.2 Ultrasensitive radical diffusion assay (URDA) 10
2.4 항균활성 물질의 정제 11
2.4.1 고상 추출을 이용한 물질의 분리 11
2.4.2 High performance liquid chromatograph (HPLC)를 사용한 항균활성 물질의 정제 12
2.5 분자량 측정 12
2.6 Histochrome®과의 retention time 비교 13
3. 결과 15
3.1 성게 체강액 추출물의 항균활성 15
3.2 항균활성물질의 정제 16
3.3 정제된 물질의 분자량 측정 24
3.4 정제된 물질과 Histochrome®의 HPLC retention time 비교 24
4. 고찰 28
요약 38
5. 참고문헌 39
Part. II Characterization and cDNA cloning of the purified novel antimicrobial peptide form visceral tissue of sea urchin, Heliocidaris crassispina 47
영문초록 48
1. 서론 49
2. 재료 및 방법 56
2.1 실험 동물 및 조직 56
2.2 보라성게의 내장 조직으로부터 추출물 조제 56
2.3 항균활성 측정 58
2.3.1 사용 균주 및 배양조건 58
2.3.2 Ultrasensitive radical diffusion assay (URDA) 58
2.3.3 최소 효과 농도 측정 (minimal effective comcentration, MEC) 58
2.4 항균활성 물질의 정제 59
2.4.1 고상 추출을 이용한 물질의 분리 59
2.4.2 High performance liquid chromatograph (HPLC)를 사용한 항균활성 물질의 정제 60
2.5 HcAMP의 분자량 측정 61
2.6 HcAMP의 1차 구조 분석 62
2.7 HcAMP의 합성 64
2.8 정제된 물질과 합성된 물질의 retention time 비교 64
2.9 HcAMP의cDNA cloning 64
2.9.1 Partial PCR 65
2.9.2 3’ RACE PCR 66
2.9.3 5’ RACE PCR 67
2.9.4 PCR product의 cloning 68
2.10.1 RT-qPCR을 통한 정제된 물질의 발현량 비교 69
2.10.2 통계처리 70
2.11 정제된 물질의 analog 제작 72
2.12 1-N-phenylnaphthylamine (NPN) uptake assay 72
2.13 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) assay 73
2.14 In silico 분석 73
3. 결과 75
3.1 보라성게 내장조직 추출물의 항균활성 75
3.2 항균활성물질의 정제 75
3.3 정제된 물질의 분자량 측정 85
3.4 정제된 물질의 아미노산 서열 분석 85
3.5 NCBI BLAST 85
3.6 전체 nucleotide sequence 86
3.7 조직별 HcAMP의 발현량 비교 86
3.8 Native와 합성된 HcAMP의 retention time 비교 92
3.9 HcAMP의 analog제작 92
3.10 HcAMP와 analog의 3차원 예측 구조 93
3.11 HcAMP와 analog의 MEC 93
3.12 HcAMP와 analog의 외막 관통 효과 95
3.13 HcAMP와 analog의 내막 관통 효과 95
4. 고찰 103
요약 124
5. 참고문헌 126
- Degree
- Master
- Appears in Collections:
- 대학원 > 해양수산생명과학부-생물공학전공
- Files in This Item:
-
-
Download
보라성게, Heliocidaris crassispina 로부터 항균성 물질의 정제 및 특성.pdf
기타 데이터 / 4.34 MB / Adobe PDF
-
Items in Repository are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.