Development of Chlorella transformation system for high-level recombinant protein expression and application for aquaculture oral vaccine production

Abstract

클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)는 재조합 단백질의 발현을 위한 플랫폼으로 많은 매력을 지니고 있는 단세포 미세조류이다. 변역 후 변형이 없는 가장 일반적으로 사용되는 대장균 플랫폼과 달리 C. vulgaris는 식물 및 동물세포와 유사한 변역 후 변형 시스템을 지니고 있다. 또한, C. vulgaris는 햇빛, 물, 이산화탄소, 미량의 영양소만으로 빠르게 성장하여 지속적으로 바이오매스 축적이 가능하며, 일시적인 발현, 긴 생산시간, 높은 비용의 단점을 지닌 곤충, 동물 및 식물세포 보다 우수한 플랫폼이다. C. vulgaris 플랫폼의 장점에도 불구하고 형질전환 과정에서 몇 가지 문제를 가지고 있다. 첫번째, 진핵생물의 특성으로 형질전환체 선별에 사용될 수 있는 항생제가 제한적이다. 두번째, 무작위 삽입에 의한 원치 않은 돌연변이가 발생한다. 세번째, 형질전환 효율이 낮다. 네번째, 형질전환 안정성이 떨어진다. 마지막으로 형질전환으로 생성되는 재조합 단백질의 수율이 낮다는 것이다. 본 연구는 C. vulgaris 플랫폼이 가지는 몇 가지 문제점을 해결하고 이를 이용하여 유용 재조합 단백질을 생산하는 것으로 목적으로 한다. 첫번째, 형질전환체 선별 시 사용가능한 항생제가 제한적이기 때문에 본 연구에서는 질산염환원효소 (NR) 유전자를 넉아웃 (knock-out)하는 원리를 이용하여 형질전환체를 선별하는 방법을 제시하였다. NR는 질산염 (NO3-)을 아질산염 (NO2-)으로 환원시키는 반응을 촉매 하는 효소이며, 이와 더불어 염소산염 (ClO3-)을 아염소산염 (ClO2-)으로 환원시키기도 한다. 이때 생성되는 ClO2-는 C. vulgaris에 독성을 나타낸다. 이러한 원리를 이용하여 도입하고자 하는 DNA 양쪽 말단에 NR 유전자 유래 DNA 절편을 위치하여 상동 재조합에 의하여 목적 DNA를 NR 유전자로 대체한 knock-out 시스템을 통하여 형질전환체를 200 mM의 KClO3가 포함된 배지에서 선별하는 방법을 개발하였다. 두번째, 무작위 삽입 및 낮은 형질전환 효율을 해결하기 위해 삽입 단편화 형질전환 시스템을 제시하였다. 삽입 단편화는 2개의 중첩 DNA 단편을 이용하여 삼중 상동재조합의 원리로 야생형 C. vulgaris의 NR 유전자를 표적으로 하여 정확한 위치에 삽입되도록 하여, 형질전환의 효율을 향상시켰다. 무작위로 선택된 형질전환된 C. vulgaris 세포의 70%가 표적 DNA에 통합되었으며, 외래 단백질의 발현을 보였다. 통합된 DNA는 KClO3가 없는 상태에서도 손실 없이 장기간 연속 계대 배양 후 검출되었다. 마지막으로, NaCl로 처리된 C. vulgaris의 전사체 분석으로부터 유도성 프로모터를 분리하였다. SIP (salt inducible promoter)라고 명명된 프로모터는 스트레스 반응 요소 (stress response element)를 포함한 14개의 시스-활성 요소 (cis-acting element)들이 확인되었다. 가우시아 루시퍼라아제 (Gaussia luciferase) 유전자를 가지고 있는 형질전환된 C. vulgaris에 스트레스 유도와 관련된 염과 메틸자스몬산 (methyl jasmonic acid), 지베렐린 (gibberellin), 앱시스산 (abscisic acid)을 처리하였을 때 재조합 루시페라아제의 발현 수준이 증가하였다. 이러한 형질전환 시스템의 적용 가능성을 평가하기 위해 전 세계 다양한 해수와 담수 물고기에서 바이러스성 출혈성 패혈증을 일으키는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (VHSV)의 당단백질과 새우 양식장에서 치사율이 100%인 흰 반점 증후군의 원인 바이러스인 흰 반점 증후군 바이러스(WSSV)의 VP28 단백질을 발현하였다. VHSV 당단백질은 총 추출된 수용성 단백질의 27.4%가 VHSV 당당백질로 확인되었으며, C. vulgaris 습윤중량 1g 당 최대 41.1 mg의 높은 수준의 발현이 달성하였다. 형질전환된 C. vulgaris를 9% 함유하는 사료를 공급한 어류의 혈청에서 중화 항체의 생산이 검출되었다. 또한, 경구 백신 접종 후 106 및 107 PFU/fish 농도의 VHSV로 어류를 감염시켰을 때 각각의 상대 생존율은 100% 및 81.9%로 달성하였다. WSSV VP28 단백질을 발현하는 형질전환 C. vulgaris를 사료에 첨가하여 경구 접종한 후 WSSV로 감염 시켰을 때 대조군에 비해 상대 생존율이 80%로 높은 방어 효율을 보였다. 또한 WSSV 감염 방어에 관여하는 것으로 알려진 프로페놀옥사이드 (prophenoloxidase), 항지질다당인자 (anti-lipopolysaccharide factor), C형-렉틴 (C type lectin) 유전자의 전사 수준이 대조군에 비해 각각 29.6배, 15.4배, 11.5배 증가하였다. |Chlorella vulgaris is a unicellular microalga has many attractive features as a platform for the expression of recombinant proteins. Contrast to Eshericha coli, the is most commonly used system that does not have post-translational modification, C. vulgaris has post-translational modification similar to plant and animal cells. Also, C. vulgaris rapidly grow and sustainably accumulate biomass using only sunlight, water, carbon dioxide, and trace nutrients which make this organism better system than insect, mammalian and plant cells that have the disadvantages of transient expression, long production time, and high cost. Despite the advantages of the Chlorella platform, some problems arise during its transformation First, due to the characteristics of eukaryotic organisms, antibiotics that can be used for the selection of transformants are limited. Second, unwanted mutations occur through random insertion. Third, the transformation efficiency is low. Fourth, the transformation stability is poor. Finally, the production of recombinant proteins by transformation is low yield. This study aims to suggest a method to solve some of these problems of the Chlorella platform and to produce useful recombinant proteins using it. First, we have developed an efficient transformation and selection system in which the NR gene that encode nitrate reductase (NR) that converts chlorate (ClO3-) to toxic chlorite (NCl2-) as well as reduce nitrate (NO3-) to nitrite (NO2-) was replaced with a DNA fragment containing a promoter, gene of interest, a transcription terminator by homologues recombination of short flanking sequences located at both ends of the target DNA, thereby transformants could be selected on plates containing 200 mM KClO3 without using any antibiotics. Second, an insert fragmentation transformation system was presented to solve the problems of random insertion and low transformation efficiency. The wild-type NR gene was knocked out by triple homologous recombination using two overlapping DNA fragments flanked by the NR fragments. Randomly selected cells showed 70% integration of the target DNA and expression of the foreign protein. The integrated DNA was detected after long-term continuous subculture without loss even in the absence of KClO3 selection pressure. Finally, an inducible promoter was isolated from the transcriptome analysis of C. vulgaris treated with NaCl. The promoter, named salt-inducible promoter (SIP) contains 14 cis-acting elements including stress response elements. Transformed C. vulgaris that has the Gaussia luciferase gene under the control of the SIP, and treatment of the cells with salt and other stress related substances including methyl jasmonic acid (MeJA), gibberellin (GA), and abscisic acid (ABA) increased the expression level of recombinant luciferase. In order to evaluate the applicability of this transformation system, the glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), which causes viral hemorrhagic septicemia (VHS) in various seawater and freshwater fish around the world and the VP28 protein of white spot syndrome virus (WSSV), which is the cause of white spot syndrome (WSD) with 100% mortality in shrimp farms were expressed. In case of VHSV glycoprotein, expression level of 41.1 mg/g wet C. vulgaris with 27.4% of total extracted soluble protein could be achieved. Oral vaccination flounder fries and white leg shrimp by mixing the transformed C. vulgaris that had been sonicated and freeze-dried showed relative survival rates up to 100% and 80%, respectively. Furthermore, the transcription levels of the prophenoloxidase (proPO), anti-lipopolysaccharide factor (ALF), and C type lectin (CTL) genes which are known to be involved in defense against WSSV infection increased 29.6, 15.4, and 11.5-fold, respectively.