Molecular Cloning and Characterization of Galectin-9 gene from Sevenband Grouper (Hyporthodus septemfasciatus)

Abstract

능성어는 한국뿐만 아니라 동아시아에서 귀중한 수산 자원들 중 하나이다. 병원균들에 의한 능성어 집단 폐사로 인하여 양식 산업에 큰 피해를 끼치고 있다. 본 연구에서는 차세대 염기서열 분석 (NGS) 기술을 이용하여 능성어 신장조직으로 전사체 분석을 진행하였고, 전사체 데이터로부터 galectin-9 유전자를 동정하고 유전자 클로닝 및 재조합 단백질로 과발현을 수행하여 분자 생물학적 수준으로 분석하였다. 전장 cDNA는 5’-UTR 부분 162 bp, 3’-UTR 부분 829 bp, 338개의 아미노산을 암호화하는 ORF 부분 1014 bp로 총 2005 bp로 구성된다. SGGal-9는 두 개 보존된 탄수화물 인식 도메인 (CRD)을 가졌다. 각 CRD는 두 개의 보존된 β-galactoside와 결합하는 모티프들을 가지고 있다. 아미노산 서열 분석에서 추정단백질은 transmembrane domain과 신호 전달 펩타이드를 포함하지 않았다. SGGal-9은 N-말단에 6X His-tag을 발현하는 pCold I 벡터에 서브클로닝을 진행하였고, E.coli BL21 (DE3)에 형질전환 시켰다. 0.1 mM IPTG를 이용하여 가용성 형태의 단백질로 발현되었다. 렉틴계 단백질의 활성을 확인할 때 사용하는 적혈구 응집반응을 수행하였고 넙치, 능성어 적혈구에서 응집과 재조합 단백질의 활성을 확인하였다. 추가로 다양한 세균의 응집 반응을 확인하였고 Lactococcus garvieae, Photobacterium damselae, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis, Vibrio parahaemolyticus, E. coli에서 응집이 되는 것을 확인하였다. Galecitn-9은 능성어 양식에서 병원균의 피해를 예방할 수 있는 대상 물질로 이용될 수 있음을 시사한다.|Grouper is one of the most valuable cultured fish in the world. However, many groupers are reported to have been susceptible to several types of pathogens and made huge economic losses. In this study, transcriptome of kidney from sevenband grouper Hyporthodus septemfasciatus was generated using next generation sequencing (NGS) technology, and the galectin-9 gene of sevenband grouper (SGGal-9) was identified from the transcriptome data and conducted gene cloning and recombinant protein overexpression for analyzing its molecular characteristics. The full-length cDNA consists of 2005 base pairs (bp), including 162 bp of 5’-untranslated region (UTR), 829 bp of 3’-UTR and 1014 bp of open reading frame (ORF) encoding a protein of 338 amino acids (aa). The SGGal-9 has two conserved carbohydrate-recognition domains (CRDs), including N-terminal CRD domain of 135 aa and C-terminal CRD domain of 123 aa. Each CRD has two conserved β-galactoside binding motifs (H-NPR and WG-EER). The putative protein does not include transmembrane domains or signal peptides. The SGGal-9 was sub-cloned into the pCold I vector expressing 6X His-tag in N-terminal. Overexpressed recombinant protein of SGGal-9 (rSGGal-9) was about 34 kDa molecular weight and expressed as a soluble form in E scherichia. coli BL21 (DE3), induced with 0.1 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). To validate the activity of the rSGGal-9, erythrocytes of olive flounder Paralichthys olivaceus, and sevenband grouper were subjected to hemagglutination and aggregated with the rSGGal-9 at minimum concentrations of 3.125 and 12.5 (μg/mL), respectively. In addition, the aggregation effect of the rSGGal-9 on various bacteria (Lactococcus garvieae, Photobacterium damselae, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis, Vibrio parahaemolyticus, and E. coli) was confirmed. Our results point out that galectin-9 is possible to use as preventive agent against bacterial infection in sevenband grouper aquaculture.