Streptococcus parauberis의 선택배지 개발 및 박테리오파지 특성 분석

Abstract

Streptococcus parauberis는 양식업에 있어 중요한 병원체이다. 본 연구에서는 국내 양식산업의 주요 세균성 질병인 연쇄구균의 원인체 Streptcoccus parauberis를 진단 및 예찰하여 치료하기 위한 선택배지 개발 및 박테리오파지를 이용한 파지 요법의 활용성을 평가하였다. 1장에서는 양식장 배출수 및 바이오필름을 비롯한 환경 시료에 존재하는 S. parauberis를 검출 및 분리할 수 있는 선택배지(BSO 배지)를 개발하였다. Oxolinic acid 5mg L-1, sodium acetate 5g L-1를 포함하는 Brain heart infusion agar의 pH를 pH 6.0으로 조절하여 제작한 선택배지에 S. parauberis 배양액을 35 oC에서 배양한 결과, BHIA (28 oC) 대비 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 현장 활용성을 평가하기 위해 환경 시료 (넙치 양식장 배출수 및 바이오필름)와 S. parauberis 혼합액 및 S. parauberis 양성 시료 (배출수 및 바이오필름)을 배양하였으며 S. parauberis를 선택적으로 분리할 수 있음을 확인하였다. 이는 본연구에서 제작한 선택배지가 환경 시료를 이용한 연쇄구균병 모니터링에 활용될 수 있음을 시사한다. 2장에서는 S. parauberis 유래 연쇄구균병을 제어하기 위하여 용균성 박테리오파지를 분리한 박테리오파지의 특성 규명 및 용균 활성을 평가하였다. 제주지역 연쇄구균병 발병 양식장의 바이오필름으로부터 박테리오파지를 분리하였으며 전자현미경을 이용한 동정 및 특성을 분석하였다. 박테리오파지 StP-JJ01은 Siphoviridae로 동정되었으며 latent period는 약 80분, burst size는 약 25 PFU cell-1로 나타났다. 안전성 시험 결과 4 – 50 oC 및 pH 4 - 10에서 감염성을 유지하였으며 다양한 열, pH 조건에서 높은 안전성을 가짐을 확인하였다. 숙주 범위의 경우 넙치 유래 S. parauberis 57균주 중 혈청형 Ia 44 균주에 대해 97.7%의 특이적인 용균 활성을 보였으며 S. parauberis 접종 후 박테리오파지 StP-JJ01을 MOI 10으로 접종한 결과 S. parauberis 단독 접종 그룹 대비 71% 증가된 84%의 생존율을 보였음을 확인하였다. 따라서 박테리오파지 StP-JJ01은 S. parauberis 혈청형 Ia 유래 연쇄구균병 치료를 위한 효과적인 생물학적 항균제로 활용될 수 있을 것으로 시료된다. |Streptococcus parauberis, recognized as the main causative agent of streptococcosis, holds significant importance as a bacterial pathogen in the aquaculture industry. However, the lack of an efficient selective media for detecting S. parauberis and the emergence of antibiotic-resistant strains pose obstacles to disease control. This study aimed to develop a selective medium (BSO medium) for detecting and isolating S. parauberis and evaluate the efficacy of lytic bacteriophage-based phage therapy as an alternative to antibiotics, addressing the challenges of current strategies. The BSO medium, incorporating oxolinic acid and sodium acetate with a pH of 6.0, successfully developed and selectively isolated S. parauberis from diseased fish and environmental samples (water and biofilm). Its recovery rates were comparable to the commonly used BHIA medium, while exhibiting superior selectivity. The bacteriophage was isolated from the biofilm of a streptococcosis-affected olive flounder farm, and used for phage therapy evaluation. Whole genome analysis based of ILLUMINA sequencing and electron microscopy classified the isolated lytic bacteriophage as a Siphoviridae family, devoid of antibiotic resistance genes and virulence factors. The phage maintained its across a wide temperature range (4 to 50 oC) and pH range (pH 4 to 10). Host range analysis demonstrated lytic activity against 97.7% of S. parauberis serotype Ia (44 strains). During the experimental period, when olive flounder was infected with S. parauberis and treated with an intramuscular injection of bacteriophage at an MOI of 10, there was a significant reduction (approximately 100-fold) in the intensity of S. parauberis infection in the spleen compared to the untreated group. This indicates that the phage treatment effectively decreased the level of infection caused by S. parauberis. Furthermore, the phage-treated group showed an average survival rate of 84%, which was approximately 71% higher than the survival rate observed in the untreated group. This suggests that the use of bacteriophage as a treatment approach has a positive impact on the survival of olive flounder infected with S. parauberis, indicating its potential effectiveness in improving the outcome of streptococcosis In conclusion, this study introduces a novel approach to diagnose and treat streptococcosis caused by S. parauberis. The development of a selective medium and implementation of phage therapy offer improved strategies for disease management. These advancements enable streptococcosis monitoring, address antibiotic resistance issues, and provide a potential reduction in antibiotic usage through the use of biological antimicrobials. The findings contribute to the development of a comprehensive solution for the effective control of streptococcosis.