한국 남동부 연안의 부유성 섬모충류에 감염하는 신디니움 와편모조류 Euduboscquella 기생 특성

Abstract

Marine planktonic ciliates have an important position in the ecological niche that transfers matter and energy from the lower to the higher trophic level in the food web. The occurrence of infections caused by parasitic organisms can induce a decline in the population of ciliates, resulting in a cascading ripple effect of food source reduction for top predators such as fish. Due to the impact of climate change, the coastal waters of the Korean peninsula are anticipated to have an increased risk of the inflow and spread of tropical parasitic organisms with rising water temperatures. Therefore, there is an urgent need to gather information to address this issue. This study examined the morphological, molecular, and ecological aspects of Euduboscquella, the parasitic dinoflagellates that infects host ciliates in the southeastern coastal areas of Korea. Additionally, water samples from the Kuroshio warm current were analyzed. Firstly, morphological analysis was conducted on living specimens and protargol-stained samples using a microscope. Secondly, molecular analysis was performed through phylogenetic analysis and the comparison of genetic distances based on ribosomal RNA gene of parasites, as well as the comparison of secondary structures of ITS2 RNA among closely related congeners. Furthermore, specific primers were designed and validated for detecting parasite Euduboscquella. Finally, ecological analysis was carried out, which involved investigating the infection level of three tintinnids, predicting the timing of host development and determining the optimal sampling period using ARIMA modeling, examining the possibility of cross-species transmission, confirming the presence of parasites infecting the ciliates of the Kuroshio warm current samples, and identifying the seasonal infection trends and hotspot areas of high incidence of aloricate ciliates. During the years of 2013 to 2016, three species of Euduboscquella parasitizing tintinnid ciliates were investigated in Jangmok Bay. Two of these species, namely E. costata and E. triangula, were recognized as novel species infecting the hosts Schmidingerella arcuata and Helicostomella longa, respectively. The other species, E. sp. infecting the host Favella ehrenbergii, was considered as a candidate new species. Based on the morphological comparison between the species of the present study and its congeners, they can be distinguished by the following characteristic differences. (1) E. costata - 25–40 radial grooves on the shield surface; chain connections are separated after second or third sporogenic division; each trophont differentiates into one of the four spore types as follows: bipartite dinospores with bulbous episome and narrow hyposome (ca. 14 μm in length), mono-flagellated oval spores (ca. 5 μm in length), non-flagellated spherical spores (ca. 8 μm in diameter), or cyst-like spores enclosed in hyaline (ca. 8 μm in length). (2) E. triangula - numerous shallow and intertwining grooves on the shield surface; chain connections are separated after second or third sporogenic division; each trophont differentiates into one of the following: mushroom-shaped dinospores (ca. 8 μm in length), spherical spores without flagella (ca. 3 μm in diameter), or triangular spores without flagella (ca. 6 × 3 μm). (3) E. sp. - inconspicuous shield; continuously maintains long chains during sporogenesis; each trophont differentiates into one of the following: bipartite dinospores with large rounded episome and small pointed hyposome (ca. 8 μm in length) or spherical spores without flagella (ca. 3 μm in diameter). The three parasitic dinoflagellates (E. costata, E. triangula, and E. sp.) are located within the Euduboscquella clade A of the phylogenetic tree. The present study species, E. sp., which is included in group I of clade A, clustered with other Euduboscquella species infecting the hosts F. ehrenbergii, F. markusovszkyi, and F. panamensis. Moreover, the present study species exhibited complete genetic identity with the E. sp., infecting F. panamensis collected from Masan Bay. Euduboscquella triangula, belonging to group III, formed a very short branch and clustered with other Euduboscquella species infecting Tintinnopsis. Euduboscquella triangula can be distinguished from closely related species with genetic distances of less than 1% by comparing the ITS2 RNA secondary structure (helices I-IV). Euduboscquella costata, belonging to group V, clustered with unidentified Euduboscquella infecting S. arcuata from Assawoman Bay in the USA. They are considered as the same species because their sequences are completely identical, and they infect the same host. Specific primers targeting the SSU rDNA V4 region were designed from the members of Euduboscquella clade A, and its effectiveness was proven through PCR amplification tests and analysis of environmental samples. Also, we obtained the sequences of three species suspected to be parasitic on aloricate ciliates. Euduboscquella costata showed a maximum infection rate of 62% during the fall of 2013, and E. triangula had a maximum infection rate of 67% during the hot summer period of 2016. Likewise, E. sp. demonstrated an extremely high infection rate of 90%. Euduboscquella costata, a parasitic dinoflagellate, was co-cultured with the original host S. arcuata and the other species F. ehrenbergii, which co-occurs during the same period. The results showed that the parasite exhibited host specificity and did not transmit the infection to other species. A comparison between the predicted values and actual observations in 2016 showed that while there were some discrepancies in accurately predicting population sizes, the model produced satisfactory results in forecasting developmental timing. Euduboscquella infection has occurred in 38% of the northwestern Pacific samples and 20% of the East China Sea samples collected during the collection of Kuroshio warm current samples in May 2013. Therefore, it has been considered that there is a high possibility of the introduction of tropical parasites into the domestic coastal area of South Korea through warm currents. The seasonal surveys conducted in the coastal waters of Jinhae, Busan, and Ulsan, all located in the southeastern region of Korea between 2013 and 2014, revealed that the most widespread infection (epizootic) occurred during the autumn season, particularly in warm waters of 18ºC and above, and in aerobic environments. The hotspot areas with frequent occurrences of infection were identified as coastal regions with semi-enclosed topography that are conducive to the accumulation of organisms, as well as the areas surrounding estuaries with appropriate levels of nutrient influx. The information regarding the diversity, life cycle characteristics, infection levels, and geographical distribution of the Euduboscquella identified in this study can be utilized as crucial foundational data for parasite response strategies. The ecological data on host-parasite organisms through periodic monitoring can be applied to predictive models for future infection outbreaks, and the designed specific primers can be used to rapidly diagnose the presence of ciliate infections in marine environments with high sensitivity. Furthermore, obtaining a range of parasitic dinoflagellates that infect host ciliates would provide an opportunity for a biological approach to controlling ciliate-associated diseases. |해양 부유성 섬모충은 먹이망에서 저차단계로부터 상위단계로 물질과 에너지를 전달하는 중요한 생태적 지위를 가진다. 기생생물에 인한 감염 발생은 섬모충 개체군 쇠락을 유도하여, 어류와 같은 상위 포식자에게 먹이원 감소와 같은 연쇄적 파급효과를 초래할 수 있다. 현재 한반도 연안은 기후변화로 인한 수온 상승으로 아열대성 기생생물 유입과 확산 위험성이 예견되고 있어, 이를 대응하기 위한 자료확보가 시급한 실정이다. 본 연구는 한국 동남부 연안의 섬모충에 감염하는 기생성 와편모조류 Euduboscquella를 대상으로 형태학적, 분자학적, 생태학적 측면으로 연구를 수행하였으며, 쿠로시오 난류수 시료를 추가 분석하였다. 형태학적 분석은 생시료와 프로타골 염색 표본을 현미경 검경 하였고, 분자학적 분석은 기생생물의 리보좀 RNA 유전자기반 계통분석과 유전자 거리 비교, 유사도가 높은 종들간 ITS2 RNA 2차구조 비교, Euduboscquella 검출을 위한 특이 프라이머를 설계 후 유효성을 검토하였다. 생태학적 분석은 유종섬모충 3종에 대한 감염 정도 분석, ARIMA 모형을 이용하여 숙주 발달 시기 예측 및 최적 모니터링 기간 산출, 숙주 특이성 시험을 통한 종간 감염 전파 가능성 진단, 쿠로시오 난류수괴 내 기생생물 존재 여부 확인, 무각섬모충의 계절별 감염 현황과 집중 발생 해역을 검토하였다. 2013-2016년 장목만에서 유종섬모충에 기생하는 Euduboscquella 3종이 확인되었고, 2종은 신종(E. costata ex. Schmidingerella arcuata와 E. triangula ex. Helicostomella longa), 1종은 신종 후보(E. sp. ex. Favella ehrenbergii)로 밝혀졌다. 본 연구종과 유사종의 형태학적 비교에서 다음과 같은 특징 차이로 구분할 수 있다. (1) E. costata - 실드 표면에 25~40개의 방사형 홈, 포자형성 중 2~3번 분열 후 사슬연결이 끊어짐, 각 영양체는 다음과 같이 최종 4종류의 포자 중 하나로 분화: 볼록한 상단부와 좁은 하단부의 와편모포자(길이 약 14 μm); 단편모 계란형포자(길이 약 5 μm); 무편모 구형포자(지름 약 8 μm); 유리질에 싸인 시스트 유사포자(길이 약 8 μm). (2) E. triangula - 실드 표면에 얕고 촘촘하게 얽힌 다수의 홈, 포자형성에서 2~3번 분열 후 사슬연결이 분리되며, 각 영양체는 버섯 모양의 와편모포자(길이 약 8 μm), 무편모 구형포자(지름 약 3 μm), 무편모 삼각형포자(약 6 × 3 μm) 중 하나로 분화. (3) E. sp. - 눈에 잘 띄지 않는 실드구조, 포자형성단계에서 긴 사슬을 지속적으로 유지, 각 영양체는 둥근 큰 상단부와 뾰족한 작은 하단부를 가진 와편모포자(길이 약 8 μm)와 무편모 구형포자(지름 약 3 μm) 중 하나로 최종 분화함. 기생성 와편모조류 3종(E. costata, E. triangula, E. sp.)은 분자계통수의 Euduboscuella 계통군 A 내부에 위치하였다. 계통군 A의 하위 그룹 I에 포함된 본 연구종 E. sp.는 숙주 F. ehrenbergii, F. markusovszkyi, F. panamensis에 기생하는 다른 Euduboscquella 종들과 군집 되었으며, 마산만 F. panamensis에 감염하는 E. sp.와 유전자가 완전히 일치하였다. 그룹 III의 E. triangula는 Tintinnopsis 에 감염하는 E. spp.와 매우 짧은 가지를 형성하며 군집 되었고, E. triangula와 유전적 거리가 1% 미만의 유사종들은 ITS2 RNA 2차구조(나선 I-IV)비교를 통해 종 구분 하였다. 그룹 V의 E. costata는 미국 아사워먼만 S. arcuata에 감염하는 E. sp.와 같이 군집 되었고, 동일한 숙주에 감염하며 유전자가 완전히 일치함으로 보아 두 종은 같은 종으로 고려된다. Euduboscquella 계통군 A 염기서열 중 SSU rDNA V4영역을 표적으로 특이 프라이머를 설계하였고, PCR 증폭 시험과 환경시료 분석을 통해 유효성을 입증하였으며, 무각섬모충에 감염하는 Euduboscquella로 추정되는 신규 3종의 염기서열을 확보하였다. E. costata는 2013년 추계 최대 62% 감염률, E. triangula는 2016년 하계 고수온기에 최대 67% 감염률, E. sp.는 2014년 늦은 하계에 최대 90%의 높은 감염률을 보였다. 기생성 와편모조류 E. costata를 숙주 S. arcuata와 동일 시기 공동 출현 종 F. ehrenbergii를 합사시킨 결과, 숙주 외 감염 전파가 일어나지 않는 숙주 특이성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 2013~2015년 간 모니터링한 유종섬모충 3종(S. arcuata, H. longa, F. ehrenbergii)의 개체군 변동 자료를 ARIMA 예측 모형에 학습시킨 후, 2016년 실측치와 예측치를 비교한 결과, 정확한 개체군 크기 예측에는 편차가 존재하였으나, 발달 시기 예측에는 준수한 결과를 나타냈다. 2013년 5월 쿠로시오 난류수 채집시료 분석 결과, 북서태평양 시료 38%와 동중국해 시료 20%에서 Euduboscquella 감염 발생이 확인되어, 난류를 통한 아열대성 기생 생물의 국내 연안 유입 가능성은 높은 것으로 검토되었다. 2013~2014년 국내 동남부에 위치한 진해, 부산, 울산 해역을 계절 조사 한 결과, 추계에 가장 많은 감염 확산이 일어났고, 약 18°C이상 수온과 호기성 환경에서 빈번히 발생하였다. 집중 감염 발생 해역은 생물 집적이 용이한 반폐쇄적 지형의 해안과 적정 농도의 영양염이 유입되는 하구 주변으로 확인 되었다. 본 연구에서 확인된 국내 출현 Euduboscquella의 종 다양성, 생활사, 감염 정도, 시공분포 정보들은 향후 기생생물 대응 전략 수립 시 기초 자료로 활용될 수 있다. 주기적인 모니터링을 통한 숙주-기생생물의 생태학적 자료는 미래 감염발생 예측 모형에 적용 가능하고, 설계된 특이 프라이머를 활용하여 수환경 내 존재하는 섬모충 감염 현황을 고감도로 신속 진단 할 수 있을 것으로 기대된다. 나아가, 섬모충에 감염하는 다양한 기생생물 종 확보는 섬모충 기인 질병을 제어하는 생물학적 방제에 도전할 수 있는 기회를 제공할 것이다.