Analysis of amino acid sequence of prolactin in fish with different salinity adaptability and swimming behavior in low salinity condition

Abstract

어류가 살아가는 환경에서 염분은 성장, 발달, 대사에 관여하는 중요한 요인 중 하나이다. Prolactin (PRL)은 뇌하수체 전엽에서 분비되며 경골어류의 이온 손실과 물 흡수를 방지해서 담수 삼투압 조절에서 중요한 역할을 한다. 선행연구에서 환경 적응력이 뛰어난 대왕바리와 붉바리를 교잡하여 만든 hybrid의 담수 적응 능력이 향상된 결과가 있다. 이에 본 연구에서는 대왕바리, 붉바리, hybrid의 PRL 서열을 비교·분석하였다. 그 결과 PRL 유전자 2,4번째 exon에 단 두 개의 아미노산만이 차이가 있음을 확인했고 이를 PRL의 핵심잔기로 판단했다. 이후 NCBI에 기록된 114종의 해수 및 담수 어종을 포함한 다양한 염분 환경에 서식하는 어류의 PRL 유전자 서열분석을 진행했다. PRL은 206-214개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 33개의 보존된 서열이 있었다. 특히 PRL의 핵심잔기인 2번째 exon에 K, 4번째 exon에 E(K/E)를 갖는 어종을 확인해 본 결과, 해수 종은 42종 중 1종만 갖고 있었지만, 담수종은 59종 중 34종이 갖고 있었다. 또한 유럽산 뱀장어(Anguilla anguilla)와 연어(Oncorhynchus keta)를 포함한 회유성 어종은 모두 핵심잔기에 K/E를 갖고 있었고, 이는 담수 적응 능력이 강한 어류의 PRL에서 핵심잔기에 K/E가 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 이를 뒷받침하기 위해 담수어종(산천어), 회유성 어종(무지개송어, 극동산 뱀장어), 해수어종(돌돔, 감성돔, 붕장어, 자리돔, 쥐치, 말쥐치, 능성어)의 PRL cDNA를 cloning 하여 분석했다. 그 결과 담수종과 회유종에는 K/E를 갖고 있었으나, 해수종인 돌돔, 감성돔, 자리돔, 쥐치, 말쥐치, 능성어는 각각 M/D, T/D, R/D, M/D, M/D, K/D를 갖고 있었다. 붕장어는 K/E를 갖고 있었으나, 이는 회유성 어종인 장어류가 K/E를 갖는 것과 일치했다. 참돔(T/D), 돌돔(M/D), 능성어(K/D), 강도다리(K/D)를 이용하여 K를 갖는 어종과 그렇지 않은 어종의 저염분 적응 능력 차이를 알아보기 위해 24 hr마다 염분을 32 psu에서 16, 12, 8, 6, 4, 2, 0 psu로 감소시켜 생존율을 확인했다. 그 결과 참돔과 돌돔, 능성어는 각각 8, 6, 4 psu에서 폐사하기 시작하여 4, 2, 0 psu에서 모든 개체가 폐사했다. 강도다리는 실험 기간 내에 폐사한 개체가 발견되지 않았다. 저염분 적응 능력의 미미한 차이를 규명하기 위해 급성으로 저염분 환경에 놓였을 때 행동 변화를 알아보았다. 30분마다 염분을 32 psu에서 16, 8, 0 psu로 감소시키고, 그 과정을 녹화 후, 유영 행동 분석을 실시했다. 그 결과 참돔, 돌돔은 32 psu에서 8 psu로 염분이 감소하는 과정에서 움직임과 속도가 단계적으로 증가했다. 0 psu에서 움직임과 속도가 감소하였고 30분 이후로는 대부분의 개체가 사망, 비정상적인 유영 활동을 하여 움직임과 속도가 감소하였다. 능성어는 32 psu에서 8 psu까지 염도를 감소하는 과정에서 유영 행동에 변화가 거의 없었으며, 0 psu에서 1시간까지 단계적으로 감소함을 보였다. 강도다리는 실험이 진행된 저염분 조건에서 변화가 없었으며 이는 강도다리가 저염분에 스트레스를 비교적 받지 않기 때문이라고 판단된다. 114종의 PRL 핵심잔기의 분포를 확인한 결과와 저염분 적응실험의 결과를 비교한 결과, PRL 핵심잔기 부위에 K를 갖는 어종이 저염분에 더 잘 적응함을 확인할 수 있었고, PRL의 핵심잔기와 저염분 적응 능력의 상관관계가 있는 것으로 예상된다.|Salinity is one of the most important factors that affect growths, development, and metabolism in fish. Prolactin is secreted in the anterior pituitary gland and has a key role in osmoregulation by preventing the loss of ions and the uptake of water in fish. Results of previous research using red-giant grouper with improved freshwater adaptability by crossbreeding the Giant grouper (Epinephelus lanceolatus) and red-spotted grouper (Epinephelus akaara), indicated that only two amino acids differed in the 2nd and 4th exons of the prolactin gene. In this study, we analyzed the corresponding sequence of the PRL gene in fish from different salinity habitat including. 114 species of seawater and freshwater fish reported in National Center for Biotechnology Information. PRLs consisted of 206-214 amino acids, with more than 33 conserved sequences. In particular, K/E sequence pair found in the 2nd and 4th exons, respectively, of PRL are of interest as the sequence pair was found in 34 out of 59 freshwater species in contrast to only 1 out of 42 marine species. It was also noticed that all the migratory moving from freshwater to seawater, or vice versa, including European eel (Anguilla anguilla) and salmon (Oncorhynchus keta), have the same K/E pair at the corresponding region. These led to a hypothesis implicating an important role of K/E pair in the PRL of fish adaptive in freshwater. In order to provide further evidence supporting the hypothesis, we analyzed cDNA cloning of PRLs from freshwater species (Oncorhynchus masou masou), migratory species (Anguilla japonica), and marine species (Oplegnathus fasciatus, Acanthopagrus schlegelii, Stephanolepis cirrhifer, Liza haematocheilus, Thamnaconus modestus, Hyporthodus septemfasciatus, Chromis notata, Conger myriaster). The result showed that the freshwater species and migratory species have K/E, but the seawater species such as Striped beakfish, Black seabream, Threadsail filefish, Pearl-spot chromis, So-iuy mullet, Convict grouper and Black scraper had M/D, T/D, T/D, R/D, K/D, K/D and M/D respectively. Presence of K/E pair found in the PRL of Conger eel was consistent with that of other migratory eel species. To find out the difference in low salinity adaptation ability between fish species with K and those without K in the corresponding region of PRL, survival rate of P. major (T/D), O. fasciatus (M/D), H. septemfasciatus (K/D), and P. stellatus (K/D) was examined upon gradually decreasing, salinity from 32 psu to 16, 12, 8, 6, 4, 2, and 0 psu for every 24 hr. The result showed that P. major, O. fasciatus, and E. septemfasciatus began to die at 8, 6, and 4 psu, respectively, and all individuals died at 4, 2, and 0 psu, respectively. No dead fish were found in P. stellatus during the experimental condition tested. In order to explore a method that could be applicable for examining a subtle difference in low salinity adaptability, behavioral analysis of the fish with different low salt adaptability was analyzed upon acute change to low-salt environment. For this, movement of fish was recorded upon, lowering salinity from 32 psu to 16, 8, and 0 for every 30 minutes. The result showed that movement and speed of P. major and O. fasciatus gradually increased as the salinity dropped from 32 psu to 8 psu followed by decreased, movement and speed in 30 minutes upon shift to 0 psu. Overall, all the fish exhibited abnormal swimming activities, resulting in decreased movement and speed and died. In contrast, E. septemfasciatus did not show any noticeable changes in swimming behavior upon lowering salinity from 32 psu to 8 psu, but showed a gradual decrease in movement distance and speed within 1 hr upon change of salinity to 0 psu. In contrast, starry flounder P. stellatus did not show any change in swimming commonalities during low salinity shift condition tested implicating P. stellatus are relatively less stressed due to low salinity. The results from the distribution of PRL core residues in 114 species and low-salt adaptability indicated that fish species with K in the PRL core residue region were better adapted to low salinity, and the core residues of PRL and we expected there to be a correlation with low salinity adaptation ability.