Applications of Bio-Engineered Tissue as Ex Vivo Model and Regenerative Therapeutics

Abstract

Chapter I. 조직공학적 각막 모델을 활용한 안 자극 평가 연구

동물실험 기반의 안 자극 평가는 미지의 물질이 인체에 어느 정도의 자극을 보이는지 평가하기 위해 수행되었지만, 실험에 이용되는 동물종과 인간과의 해부 생리학적 차이와 윤리적 문제 등으로 대체법이 요구되었다. 현재, 대다수의 국가에서는 화장품 및 약물의 개발에 있어 동물 실험 결과가 아닌 대체 시험법으로 도출된 결과를 인정해 주며 대체 시험 평가법에 대한 중요성이 나날이 커진다. 현재 상용화되어 있는 각막 평가 모델의 경우, 각막 상피 세포를 투과성 막이 부착된 트랜스 웰 시스템에 배양한 뒤 이를 공기 중에 노출하여 분화시킨다. 해당 배양 과정을 통해 각막 상피 세포는 편평한 형태를 보이며, 이를 활용하여 다양한 제형 약물의 자극성을 평가한다. 각막의 경우 세 가지로 분류되는 층을 가지고 있으며, 그중 콜라겐이 풍부하게 형성된 실질 조직은 각막 전체 두께의 대부분을 차지하는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 현재 상용화된 각막 평가 모델의 경우 각막 상피층만 구현되어 있으며 편평한 모양을 지니고 있다. 이는 본래 조직의 굴곡이 반영되지 않았으며, 실질 층이 포함되지 않았기 때문에 약물이 어느 정도 깊이로 조직을 손상하는지 알 수 없다. 이에, 본 연구는 세포의 자가조립 기능을 기반으로 제작된 반구 형태의 각막 유사 조직체를 트랜스 웰 시스템에 적용하여 미니 각막 모델을 완성하였으며, 이를 안 자극 평가에 이용하였다. 미니 각막 모델 제작을 위해 불멸화 된 각막 상피 및 실질 세포를 활용하였으며, 세포의 자가조립 기능 조절 및 세포 외 기질을 풍부하게 생성하기 위해 아스코르브산을 활용하였다. 자극 평가 수행을 위해 화학물질 분류 및 표지 세계 조화시스템 내에서 다양한 화학 물질을 선택하였으며, 이를 직접적으로 각막 모델에 처리하여 세포 생존율 분석을 수행하였다. 연구 수행을 통해 자극 정도가 심해질수록 세포의 생존율 또한 급격하게 감소하는 경향을 확인할 수 있었으며, 평가 후 조직학적 관찰을 통해 화학 물질마다 다른 깊이로 세포의 형태가 바뀐 것을 알 수 있었다. 본 연구 수행을 통해 두 가지 각막 층을 지니며 실제 안구와 유사하게 반구 형태를 지닌 각막 모델을 제작하였으며, 평가 분석을 통해 대체 평가법으로써의 가능성을 확인할 수 있었다.|Chapter II. 주입형 힘줄 치료제의 제작 및 아킬레스건 결손 모델 상 유효성 확인 연구

힘줄은 근육에서 발생한 기계적 힘을 뼈로 전달하는 다리 역할을 수행하는 주요 결합 조직으로, 관절과 더불어 인체의 움직임을 안정적으로 지지한다. 이렇듯 힘줄은 일생에 걸쳐 다양한 움직임에 의해 사용되기에 사용 빈도가 매우 높은 편이라 노화가 진행됨에 따라 쉽게 손상될 수 있다. 그러나, 힘줄은 조직을 구성하는 세포가 매우 적고 주변에 혈관 및 신경이 적게 존재하는 특징을 지니어 재생 능력이 한정적이다. 현재 찢어지거나 파열된 힘줄을 치료하기 위해서는 외과적으로 끊어진 두 부분을 봉합하는 방법이 수행되고 있으나 봉합한 부위의 재손상 비율이 높은 편이며, 이어진 부분에서 콜라겐 섬유의 배열이 다양한 방향으로 형성되어 기계적 강도 회복에 어려움을 겪는다. 이에 본 연구는 세포 시트 공학 기술을 이용하여 힘줄에 가장 많이 존재하는 tenocyte와 세포가 생산해 낸 세포 외 기질을 활용하였으며, Teno-Putty라는 주입형 조직 치료제를 개발하여 아킬레스건 결손 모델에 적용 후 결손부에 대한 재생 효능을 확인하였다. 실험을 진행한 결과, 기계적 강도 회복 측면에서는 주목할 만한 결과를 얻진 못하였지만, 조직학적 분석을 통해 결손 부위에서 새로 생겨난 조직들이 주변 힘줄 조직과 잘 융화되어 일렬로 배열된 콜라겐 섬유를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 이외에도, Teno-Putty를 이식한 그룹에서 연골과 유사한 조직이 아닌 본래 힘줄과 유사한 조직이 형성되었음을 관찰할 수 있었고 단일 세포를 주입한 그룹에 비하여 조직의 성숙도가 향상된 것 또한 확인할 수 있었다. 이는 같은 시간에도 더욱 성숙한 조직으로 분화할 수 있는 가능성을 보여줬다. 본 연구는 세포 시트를 활용한 주입형 조직 치료제에 대한 연구로, 다양한 세포원에도 적용할 수 있는 유효한 기술이라 판단된다. 또한, 본 기능성 생체재료와의 복합화를 통해 더욱 효과적인 치료제 개발로도 활용할 수 있다.|Chapter I. Fabrication and Evaluation of Tissue-Engineered Cornea Model for Eye Irritation Test

Eye irritation tests on animals have been conducted for many years. However, these tests face significant challenges, including subjective irritation assessments, anatomical and physiological differences between animals and humans, and ethical concerns. In response, we have developed alternative testing methods. This study focused on fabricating in vitro mini-cornea models using immortalized human corneal epithelial cells (iHCECs) and keratocytes (iHCKs) for irritation testing. The study hypothesized that the mini-cornea model could demonstrate distinct viability patterns in response to chemicals with varying irritancy levels. The cells were characterized using cornea-specific markers through immunocytochemistry and western blot. To mimic a 3D hemisphere construct resembling corneal stroma, iHCKs were cultured under optimized conditions verified by matrix formation and total collagen content. iHCECs were then seeded on the construct and cultured at an air-liquid interface. The model was exposed to test chemicals, including 2-phenoxyethanol, Triton X-100, sodium lauryl sulfate, and benzalkonium chloride. Both iHCECs and iHCKs exhibited their specific markers. Among various culture conditions, the addition of ascorbic acid (200 µg/ml) resulted in an intact cellular matrix with the highest collagen content, making it ideal for constructing the mini-cornea model. Histological analysis revealed the model's hemisphere shape and homogeneous cell distribution. The study observed varying sensitivity levels based on chemical types, with model viability decreasing as chemical concentration increased. This tissue-engineered mini-cornea model effectively mimicked irritation responses and demonstrated potential as a reliable alternative to animal testing. These findings suggest its application could address ethical concerns and improve the relevance of irritation testing methods.|Chapter II. Application of Injectable Tissue for Tendon Regeneration in Achilles Tendon Defect Rat Model

Tendons connect muscles to bones, transmitting mechanical forces. The Achilles tendon, the largest and strongest in the body, is prone to damage from excessive movement, wear, injury, inflammation, and aging. Conventional treatments like corticosteroid injections and surgical suturing often lead to complications, such as disorganized collagen fibers and reduced tendon strength. Cell therapy in tissue engineering showed promise but is limited by poor cell survival and localization after injection. To address these issues, we developed Teno-Putty, an injectable form of cells with high-purity extracellular matrix (ECM) released from the cells. Culturing cells under low oxygen accelerated cell proliferation and ECM production, improving cell sheet formation. This study hypothesizes that Teno-Putty cultured under hypoxia enhances Achilles tendon regeneration more effectively than single-cell injections. The isolated tenocytes were characterized using tendon-specific markers like Collagen type I, III, Tenascin-C, Tenomodulin, and Decorin. Hypoxic conditions were verified by the hypoxia-inducible factor 1α expression. After fabricating Teno-putty, we tested its viability and applied it to the Achilles tendon defects rat model, comparing results with positive control, negative control, and single-cell injected groups. Macroscopic scoring evaluated tendon regeneration using post-operative tendons, mechanical properties, and histological observation with H&E, picrosirius red, Safranin-O, and Masson’s trichrome. The results represented that hypoxia promotes cell proliferation, ECM accumulation, and cell sheet stability. Teno-putty demonstrated improved tendon repair, mimicking natural tendon structure and function compared to conventional treatments. This approach highlights hypoxia-cultured Teno-putty as a promising advancement for tendon regeneration, offering enhanced mechanical stability and accelerated healing, potentially overcoming current limitations in cell therapy and surgery.