Development of selective viability-quantitative PCR for white spot syndrome virus using propidium monoazide

Abstract

흰반점바이러스(white spot syndrome virus; WSSV)는 새우에 심각한 폐사율을 유발하는 고병원성 바이러스로, 그 전파를 억제하기 위해서는 신속하고 효율적인 진단법이 필수적이다. 일반적으로 바이러스 진단에 사용되는 quantitative PCR (qPCR)은 capsid와 envelope의 온전함과는 무관하게 표적 염기서열을 증폭시키므로 바이러스의 실제 감염능을 반영하는 데 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하고자 모노아지드기를 가진 viability dye를 활용한 viability-quantitative PCR (v-qPCR)의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 본 연구에서는 capsid와 envelope가 손상되지 않은 WSSV를 선택적으로 검출하기 위해 PMAxx를 사용한 v-qPCR을 개발하고, 이를 통해 WSSV의 감염능을 평가할 수 있는 신속하고 정확한 진단법으로써 활용 가능성을 제시하였다. v-qPCR의 최적화를 위해, WSSV의 enveloped protein VP28을 표적으로 하는 157 bp 크기의 증폭산물을 생성하는 qPCR을 개발하였다. 개발된 qPCR의 민감도는 5.04 copies/μL (95% CI, 3.57 – 11.03 copies/μL)로 나타났으며 진단 민감도 및 특이도는 WSSV 확정 진단에 사용되는 qPCR과 비교하였을 때 각각 97.06%, 100%로 나타나 우수한 성능을 보였다. 최적화 과정을 통해, 157 bp의 amplicon을 생성하는 qPCR과 50 μM 농도의 PMAxx를 사용하는 v-qPCR 조건이 구조적 온전함을 상실한 WSSV가 구조적 온전함을 보존한 WSSV에 비해 효율적이고 높은 ∆Ct value를 보여 적합한 조건임을 도출하였으며 최적화된 v-qPCR은 선형회귀분석에서 구조적 온전함을 보존한 WSSV 비율에 따라 유의미한 상관관계를 보였고 (R2 = 0.906) 생존분석 결과, 감염능과도 유의미한 상관관계를 나타냈다 (P < 0.0001). 개발된 vqPCR을 이용하여 WSSV의 안정성 평가 결과, WSSV는 4℃에서 보다 25℃에서 상대적으로 안정적이었으며, 해수에서 PBS보다 상대적으로 불안정한 것으로 나타났다. 또한, WSSV에 감염된 흰다리새우(Penaeus vannamei) 부속지 및 근육조직 마쇄액을 반복적인 freeze/thaw (F/T) cycle에 노출시켰을 때, 14 F/T cycles 동안 qPCR 상에서는 viral copy number가 유지되었지만, v-qPCR 상에서는 1 F/T cycle 부터 WSSV의 안정성이 급격하게 감소하였다. 추가적으로 v-qPCR을 흰다리새우 부속지 및 근육조직 마쇄액과 홍합 (Mytilus coruscus) 중장선조직 마쇄액에 spike된 WSSV에 적용하였을 때, 감염능을 보존한 WSSV particle을 성공적으로 구별할 수있었다. 이러한 결과들은 v-qPCR이 WSSV의 감염능을 평가하는 데 있어 신속하고 신뢰할 수 있는 접근법임을 시사한다.